從巨噬細胞Ipr1基因功能研究探討結核分枝桿菌感染固有免疫的調節(jié)機制.pdf

1、2005年，哈佛大學的Pan等在小鼠巨噬細胞內發(fā)現了一個介導巨噬細胞抗胞內病原體的基因--胞內病原體抗性基因1（intracellular pathogen resistance1，Ipr1），該基因與結核病的易感性有著密切的聯系。表達Ipr1基因的小鼠，感染Mtb后巨噬細胞發(fā)生凋亡，細菌不易增殖。而Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬細胞表現為壞死，從而利于細菌在宿主體內的增殖與擴散。然而，Ipr1基因增強巨噬細胞抗結核分枝桿菌感染

2、的機制還不清楚。 本課題通過RT-PCR法從C57BL/6J小鼠胸腺組織中獲取Ipr1基因，構建真核表達質粒pEGFP-Ipr1，觀察Ipr1基因在細胞水平調節(jié)巨噬細胞抗分枝桿菌的作用。構建Ipr1和綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）真核共表達穿梭質粒pBGOI，然后將該穿梭質粒電轉到卡介苗BCG中，構建可靶向遞送pBGOI質粒進入巨噬細胞中進行表達的重組卡介苗BCGi，并在細胞水平和小鼠

3、體內觀察該重組卡介苗的表達。通過重組卡介苗BCGi靶向遞送Ipr1基因于感染Mtb的小鼠體內，觀察重組卡介苗BCGi對小鼠Mtb感染的作用，運用基因芯片技術、蛋白芯片技術、Real-time PCR、ELISA檢測實驗組和對照組與免疫相關分子的表達差異，初步探討Ipr1基因在抗Mtb感染中的可能的作用機制。 第一部分Ipr1基因表達對巨噬細胞抗分枝桿菌感染的影響。 目的：獲取Ipr1基因全長編碼序列，構建Ipr1基因與E

4、GFP基因融合表達載體，鑒定Ipr1基因在小鼠巨噬細胞株RAW264.7中的表達及細胞內定位，觀察Ipr1基因的表達對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞體外殺傷結核分枝桿菌H37Ra作用的影響。 方法：從C57BL/6J小鼠胸腺組織提取總RNA，以RT-PCR法調取Ipr1基因編碼序列，克隆至真核表達載體pEGFP-C1，獲得真核表達質粒pEGFP-Ipr1，經PCR、酶切鑒定正確后，脂質體轉染pEGFP-Ipr1至小鼠巨噬細胞

5、株RAW264.7，采用RT-PCR法，Western blotting法分別在轉錄水平及翻譯水平檢測Ipr1基因的表達及激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達及細胞內定位。應用G418壓力篩選穩(wěn)定表達Ipr1基因的小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，獲得高表達Ipr1基因的巨噬細胞。體外感染分枝桿菌H37Ra，感染后24h及96h細胞裂解物細菌培養(yǎng)菌落計數（CFU）的方法觀察巨噬細胞抗結核分枝桿菌H37Ra感染活性。 結果：從C5

6、7BL/6J小鼠胸腺組織內擴增出大小為1338bp片段。成功構建了重組真核表達質粒pEGFP-Ipr1，轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7，經RT-PCR、Western blotting鑒定Ipr1基因在轉錄水平及翻譯水平獲得表達，共聚焦顯微鏡觀察Ipr1融合綠色熒光蛋白表達產物定位于細胞核內。經G418壓力篩選后獲得穩(wěn)定表達Ipr1基因的RAW264.7細胞。細胞水平抗分枝桿菌H37Ra實驗結果顯示Ipr1基因表達的實驗組巨噬細胞裂

7、解物細菌培養(yǎng)菌落計數（CFU）低于對照組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。 結論：成功獲取小鼠Ipr1基因全長編碼序列，構建了Ipr1基因與EGFP基因融合表達質粒pEGFP-Ipr1，Ipr1基因表達產物定位于細胞核內。G418壓力篩選出高表達Ipr1基因的細胞。體外抗菌實驗表明Ipr1基因的表達增強了巨噬細胞殺傷胞內吞噬的結核分枝桿菌H37Ra的能力。 第二部分靶向遞送pBGOI真核質粒的重組BCGi的構建及

8、鑒定。 目的：構建Ipr1和綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）真核共表達穿梭質粒pBGOI，并在人肺腺癌細胞株A549中進行表達。構建可靶向遞送pBGOI質粒進入巨噬細胞中進行表達的重組卡介苗BCGi，并在細胞水平和小鼠體內觀察該重組卡介苗的表達。 方法：將GFP基因、分枝桿菌復制子OriM和Ipr1基因同時克隆入雙啟動子真核共表達載體pBudCE4.1質粒中，構建pBOGI穿梭質

9、粒，脂質體法轉染pBOGI質粒于培養(yǎng)的A549細胞中，RT-PCR法、免疫組化、Western Blotting、熒光顯微鏡檢測Ipr1和GFP的表達.將pBGOI電轉入卡介苗BCG中，構建重組卡介苗BCGi，PCR進行鑒定，擴增，將BCGi導入RAW264，7細胞后作RT-PCR、Western Blotting檢測目的基因的表達。重組BCGi滴鼻方式免疫BALB/c小鼠，以RT-PCR法，免疫組化法檢測肺脾組織中目的基因的表達。

10、 結果：酶切和測序分析表明pBGOI真核共表達穿梭質粒構建成功.pBGOI轉染A549細胞后，RT-PCR、Western Blotting法檢測到目的基因的表達。熒光顯微鏡觀察到轉染細胞中有綠色熒光蛋白表達，免疫組化可以檢測到Ipr1蛋白的表達。菌落PCR鑒定重組卡介苗BCGi構建成功，BCGi導入RAW264.7細胞，RT-PCR法檢測到目的基因的表達。重組BCGi滴鼻免疫的方式免疫BALB/c小鼠，RT-PCR法，免疫組化法檢

11、測到肺脾組織中目的基因的表達。 結論：成功構建真核共表達穿梭質粒pBGOI，成功構建重組卡介苗BCGi，為進一步研究Ipr1的功能及作用機制奠定基礎。 第三部分 Ipr1基因抗小鼠Mtb感染的作用及機制的初步探討。 目的：重組卡介苗BCGi靶向遞送Ipr1基因于感染結核分枝桿菌的小鼠體內，觀察重組卡介苗BCGi對小鼠結核分枝桿菌感染的作用及可能的分子機制。 方法：用BCGi免疫感染了結核分枝桿菌Mtb的C

12、3HeB/FeJ小鼠，3周后處死，檢測肺脾器官荷菌量、肺脾病理學改變、以及Ipr1在肺組織的表達，并做小鼠肺組織基因芯片檢測、小鼠肺組織Real-time PCR檢測、小鼠血清細胞因子蛋白芯片檢測、小鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ的檢測。 結果：重組BCGi組肺脾器官荷菌顯著降低。重組BCGi組小鼠肺組織病變范圍和程度輕于PBS組和BCG組。免疫組化檢測到小鼠肺組織中有Ipr1的表達?；蛐酒Y果中BCGi組比BCG組

13、上調2倍的基因有：Igh-6、Lbp、Ltf、Ly96、Ncf4、Nfkb1、Nfkb2、Nfkbia、Nos2、Prg2、Sftpd、Stabl、Tlr4。Real-time PCR實驗結果Fas、Mcl1、Bc12、Caspase3、iNOS、LRG47、NRAMP1基因上調。血清蛋白芯片結果，BCGi組比BCG組下調1.3倍的炎癥細胞因子有Eotaxin、Eotaxin-2、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-10、IL-17、