副結核分枝桿菌SOD基因對實驗動物免疫研究.pdf

1、副結核病(paratuberculosis)又稱Johne's病，是由分枝桿菌屬副結核分枝桿菌(Mycobacterium avium ssp.paratuberculosis，MAP)引起的一種以反芻動物為主的慢性、消耗性傳染病。目前，該病在世界廣泛流行，以奶牛業(yè)和肉牛業(yè)發(fā)達的國家危害嚴重，現(xiàn)已成為飼養(yǎng)業(yè)嚴重流行的傳染病之一。另外，國外從人的Crohn's病患者體內分離出MAP。因此，Johne's病已引起了全世界的廣泛關注。

2、 目前，該病尚無有效的治療藥物，因此該病的預防主要采取檢出、隔離或淘汰，即以副結核PPD進行檢疫，對檢出的陽性牛進行隔離與淘汰。此外，國內外也有采用預防接種的方法來控制該病，即將MAP熱滅活或致弱后制成疫苗，免疫接種牛和羊，可降低該病的發(fā)生率。但是疫苗接種后會使動物血清轉為陽性，干擾變態(tài)反應和血清學檢測，以及對結核菌素敏感，妨礙牛結核病和副結核病的變態(tài)反應檢測。因此，有待開發(fā)新型的預防疫苗和診斷試劑，以促進畜牧業(yè)的健康發(fā)展。 研

3、究發(fā)現(xiàn)，副結核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在的大量分泌蛋白能有效地誘發(fā)對副結核分枝桿菌的抵抗性，產生免疫保護作用。其中，SOD是副結核分枝桿菌的一種主要分泌蛋白。DNA疫苗能有效地刺激機體產生持久的體液免疫和細胞免疫應答，其中，激活CTL及殺滅靶細胞是DNA疫苗發(fā)揮保護作用的最主要機制之一，而且不干擾變態(tài)反應檢測，這正是抗副結核感染所必需的。 為了研制牛副結核病新型的預防制劑，尤其是DNA疫苗，本研究將重組質粒pGEM-T-SOD中的S

4、OD基因亞克隆至真核表達載體pVAX1中，成功地構建出真核表達重組質粒pVAX1-SOD。以脂質體介導法將pVAX1-SOD轉染至BHK-21細胞中，通過熒光抗體技術和RT-PCR方法證實SOD基因在哺乳動物細胞中獲得了表達。 以pVAX1-SOD分別對BALB/c小鼠和豚鼠進行了免疫，同時設pVAX1、生理鹽水、副結核分枝桿菌超聲抗原對照組。淋巴細胞轉化試驗結果表明，pVAX1-SOD免疫組與對照組間沒有顯著差異(P>0.05

5、)。小鼠脾臟CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞檢測結果顯示，pVAX1-SOD免疫組的CD4+T、CD8+T細胞數(shù)量與生理鹽水、pVAX1對照組間沒有差異，而CD3+T細胞數(shù)量則存在差異，但沒有達到統(tǒng)計學上的顯著水平(P>0.05)。pVAX1-SOD免疫小鼠脾細胞培養(yǎng)上清的IFN-γ含量顯著地高于生理鹽水、pVAX1對照組(P<0.05)。間接ELISA檢測結果表明，免疫小鼠體內產生了針對SOD抗原的特異性抗體。豚鼠變態(tài)反應結果顯