活化巨噬細(xì)胞控制結(jié)核分枝桿菌感染與自噬的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　了解IFN-γ活化的THP-1源巨噬細(xì)胞分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌3個(gè)菌株(mCherry-BCG、H37Rv、MDR)感染的控制效力,并探討感染過(guò)程中結(jié)核分枝桿菌生存與巨噬細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1.利用博奧晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)對(duì)3個(gè)菌株mCherry-BCG、 H37Rv、MDR進(jìn)行菌種鑒定,并通過(guò)TCH、PNB鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)鑒定菌株分型;通過(guò)藥敏培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)確定

2、3個(gè)菌株的耐藥譜。
　　2.PMA(佛波酯)誘導(dǎo) THP-1分化,并從細(xì)胞貼壁、形態(tài)變化、細(xì)胞膜表面標(biāo)志分子CD11b表達(dá)這三方面綜合鑒定 THP-1是否已分化成巨噬細(xì)胞。PI/AnnexinV-FITC雙染法FCM檢測(cè)THP-1源巨噬細(xì)胞的凋亡情況。
　　3.IFN-γ致敏后再激活巨噬細(xì)胞,通過(guò)ELISA檢測(cè)其分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-10的情況判斷IFN-γ活化的M1型巨噬細(xì)胞模型建立與否。
　　4.濁度儀定量

3、3個(gè)菌株,各自以 MOI(感染復(fù)數(shù))10:1感染未活化(control組)、IFN-γ活化(IFN-γ組)、Rapamycin誘導(dǎo)自噬(Rapamycin組)、3MA抑制自噬(IFN-γ+3MA組)4組不同處理的巨噬細(xì)胞48h,稀釋涂板法檢測(cè)感染各組巨噬細(xì)胞的各個(gè)菌株的相對(duì)生存率。
　　5.Western Blot檢測(cè)受感染的各組巨噬細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)水平。
　　6.采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.

4、05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)菌種鑒定,3個(gè)菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。TCH、PNB鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)鑒定mCherry-BCG為牛型結(jié)核分枝桿菌,鑒定H37Rv、MDR為人型結(jié)核分枝桿菌;藥敏培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)鑒定mCherry-BCG、H37Rv為敏感菌株,鑒定MDR為耐多藥菌株(利福平、異煙肼耐藥)。
　　2.經(jīng)PMA10 ng/mL誘導(dǎo)48 h再靜息3天,不貼壁的THP-1分化成貼壁的細(xì)胞,

5、細(xì)胞形態(tài)變化明顯,與人外周血人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞形態(tài)相似;同時(shí)較誘導(dǎo)前明顯表達(dá)巨噬細(xì)胞膜表面分子CD11b;而且細(xì)胞凋亡率較小。
　　3.IFN-γ致敏后再激活的巨噬細(xì)胞大量分泌TNF-α,不分泌IL-10,說(shuō)明巨噬細(xì)胞已被誘導(dǎo)向M1型活化。
　　4.mCherry-BCG生存率:Control組100％±0%,IFN-γ組48%±25%,Rapamycin組55%±12%,IFN-γ+3MA組81%±10%,經(jīng)One-

6、Way ANOVA后Dunnett法檢驗(yàn),與Control組比較,感染IFN-γ組巨噬細(xì)胞的mCherry-BCG生存率明顯下降(P<0.01),Rapamycin組明顯下降(P<0.05),IFN-γ+3MA組無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　H37Rv生存率:Control組100%±0%,IFN-γ組104%±8%,Rapamycin組55%±3%,IFN-γ+3MA組111%±15%,經(jīng)One-Way ANOVA后Dunn

7、ett法檢驗(yàn),與Control組比較,感染IFN-γ組巨噬細(xì)胞的H37Rv生存率無(wú)明顯差異(P>0.05),Rapamycin組明顯下降(P<0.01),IFN-γ+3MA組無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　MDR生存率:Control組100%±0%,IFN-γ組109%±6%,Rapamycin組21%±3%,IFN-γ+3MA組100%±12%,經(jīng)One-Way ANOVA后Dunnett法檢驗(yàn),與Control組比較,感染

8、IFN-γ組巨噬細(xì)胞的MDR生存率無(wú)明顯差異(P>0.05),Rapamycin組明顯下降(P<0.01),IFN-γ+3MA組無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　5.受mCherry-BCG感染的巨噬細(xì)胞:與Control組比較,IFN-γ組自噬水平明顯增高,Rapamycin組自噬水平明顯增高,IFN-γ+3MA組自噬水平無(wú)增高。
　　受H37Rv感染的巨噬細(xì)胞:與Control組比較,IFN-γ組自噬水平無(wú)明顯增高,Ra

9、pamycin組自噬水平明顯增高,IFN-γ+3MA組自噬水平無(wú)增高。
　　受MDR感染的巨噬細(xì)胞:與Control組比較,IFN-γ組自噬水平無(wú)明顯增高,Rapamycin組自噬水平明顯增高,IFN-γ+3MA組自噬水平無(wú)增高。
　　結(jié)論:
　　1.IFN-γ活化的THP-1源巨噬細(xì)胞控制各種結(jié)核分枝桿菌感染生存的效力高低與自身發(fā)生自噬水平的高低呈明顯正相關(guān),提示自噬在其殺菌機(jī)制中占據(jù)相當(dāng)重要的位置。
　　2.