Seladin-1在雄激素抗Aβ25-35誘發(fā)C6膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目標(biāo)
　　 先前的研究證明選擇性阿爾茨海默病指示因子1(Selective Alzheimer’sdisease indicatot-1，seladin-1)是一個重要的神經(jīng)保護(hù)因子。因此，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Seladin-1可能是雄激素的的一個下游目標(biāo)基因。然而，Seladin-1在雄激素神經(jīng)保護(hù)作用中的意義及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍然沒有完全明了。在本研究中，我們首先通過觀察雄激素對Aβ25-35誘發(fā)的C6細(xì)胞增殖活性變化及細(xì)

2、胞凋亡活動的影響，同時觀察在雄激素保護(hù)作用中雄激素對C6細(xì)胞seladin-1表達(dá)的影響。此外，在雄激素激素對seladin-1表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究中，我們將進(jìn)一步探討經(jīng)典的基因信號通路、PI3-K/Akt/GSK3 B/B-catenin信號通路、MAPK/ERK/CREB信號通路對seladin-1表達(dá)的影響及其潛在的分子作用機(jī)制，進(jìn)一步闡明雄激素神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 研究方法
　　 在本研究中，我們利用體外培養(yǎng)

3、的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)株作為體外膠質(zhì)細(xì)胞研究模型，通過觀察雄激素對Aβ5-35誘導(dǎo)的C6細(xì)胞增殖活性抑制(采用MTT法)與細(xì)胞凋亡活動的潛在保護(hù)作用(采用Hoechst-PI雙標(biāo)記染色法)，初步觀察雄激素對C6膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，我們還利用免疫印跡檢測(Westernblot)技術(shù)和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR)技術(shù)，進(jìn)一步評價雄激素保護(hù)作用與Seladin-1表達(dá)之間的

4、關(guān)系及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 研究結(jié)果
　　 第一部分
　　 在本部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35對C6細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞增殖活性抑制效應(yīng)，而雄激素具有非常顯著抑制Aβ25-35誘發(fā)的細(xì)胞增殖活性下降作用。同時，我們在熒光顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35對C6細(xì)胞具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，而雄激素可以明顯拮抗其誘發(fā)的凋亡活動。上述結(jié)果提示，雄激素對Aβ25-35誘發(fā)的C6細(xì)胞凋亡具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

5、>　　 我們進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，雄激素處理后的C6細(xì)胞Seladin-1表達(dá)顯著增加，而Aβ25-35單獨(dú)處理組C6細(xì)胞Seladin-1表達(dá)輕度下降。睪丸酮誘導(dǎo)的凋亡保護(hù)蛋白Seladin-1表達(dá)上調(diào)效應(yīng)能夠被雄激素受體阻斷劑氟他胺所顯著抑制。上述結(jié)果進(jìn)一步證明，雄激素可能通過上調(diào)Seladin-1蛋白而產(chǎn)生抗凋亡保護(hù)效應(yīng)。
　　 第二部分
　　 在本部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在Seladin-1的蛋白質(zhì)合成和基因轉(zhuǎn)錄水平上

6、所有濃度的睪丸酮(實(shí)驗(yàn)用)均可以顯著增加C6膠質(zhì)細(xì)胞的Seladin-1表達(dá)水平。而選擇性的雄激素受體(AR)阻斷劑氟他胺(Flutamide)可以呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性地阻斷雄激素誘導(dǎo)的C6細(xì)胞Seladin-1的上調(diào)表達(dá)。上述資料提示，Seladin-1是雄激素的下游目標(biāo)基因之一，睪丸酮通過經(jīng)典受體基因信號通路介導(dǎo)了Seladin-1基因的表達(dá)。
　　 第三部分
　　 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在C6細(xì)胞上睪丸酮可以明顯提高V-

7、akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因(V-akt murine thymoma viral oncogene，AKT)激酶(AKT激酶)的磷酸化激活水平。AKT激酶作為細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3-K)/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(即PI3-K/Akt信號通路)激活的關(guān)鍵性效應(yīng)因子，是PI3-K/AKT信號通路激活的主要標(biāo)志之一。但是，睪丸酮誘導(dǎo)的AKT激酶的磷酸化激活可以明顯被特異性、選擇性的

8、P13-K抑制劑LY294002所抑制。上述結(jié)果支持，在C6細(xì)胞上睪丸酮可以直接激活C6細(xì)胞的PI3-K/Akt信號通路。
　　 此外，我們也發(fā)現(xiàn)睪丸酮可以明顯促進(jìn)P13-K/AKT信號通路下游的關(guān)鍵信號蛋白分子糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase3 beta，GSK-3β)磷酸化修飾活動，而GSK3β25-35的下游作用底物，即輔助轉(zhuǎn)錄因子β-連鎖蛋白(Beta-catenin，β-cateni

9、n)表達(dá)也受睪丸酮誘導(dǎo)后明顯升高。但是，而PI3-K抑制劑LY294002可以明顯阻斷睪丸酮誘導(dǎo)的下游信號分子GSK3 B磷酸化作用，而選擇性PI3-K抑制劑LY294002也明顯阻斷了睪丸酮誘發(fā)的下游β-catenin表達(dá)升高。上述資料提示，睪丸酮通過上游PI3-K/Akt通路進(jìn)一步激活了下游的GSK3β/β-catenin信號通路。綜合上述的結(jié)果提示，在C6細(xì)胞上睪丸酮可以直接激活C6細(xì)胞的PI3-K/AKT/GSK3β/β-cat

10、enin細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 我們也發(fā)現(xiàn)，在PI3-K/Akt信號通路的上游信號通路上，不同濃度的選擇性P13-K抑制劑LY2940023可以在蛋白質(zhì)合成和基因轉(zhuǎn)錄水平上呈現(xiàn)明顯抑制睪丸酮誘發(fā)的seladin-1基因的上調(diào)表達(dá)作用。同時，在PI3-K/Akt通路的下游GSK3β/β-catenin信號通路上，我們發(fā)現(xiàn)選擇性GSK3β抑制劑SB216763可以明顯阻斷GSK3β功能活性而誘導(dǎo)β-catenin蛋白表達(dá)升高。而通

11、過誘導(dǎo)β-catenin蛋白聚集升高，SB216763也明顯激活TSeladin-1基因的表達(dá)。所以，綜合上述的結(jié)果，我們的資料支持睪丸酮部分通過PI3-K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路上調(diào)seladin-1基因的表達(dá)。
　　 第四部分
　　 在絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal

12、-regulated kinase，ERK)(MAPK/ERK)信號通路作用的研究中我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的睪丸酮(實(shí)驗(yàn)選擇)均可以快速、顯著地促進(jìn)ERK1、ERK2的磷酸化水平升高，睪丸酮對ERK1、ERK2激活效應(yīng)在24小時左右恢復(fù)到基線水平。ERK1、ERK2磷酸化激活也是MAPK/ERK細(xì)胞信號通路激活的主要標(biāo)志之一，而ERK1、ERK2也在MAPK/ERK細(xì)胞信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。上述資料提示，在睪丸酮效應(yīng)中MAPK/ERK

13、信號通路可能在早期起到短暫、快速的效應(yīng)作用。
　　 此外，我們也觀察了睪丸酮對MAPK/ERK信號通路下游的關(guān)鍵信號分子--cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding：protein，CREB)磷酸化活動的激活作用。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的睪丸酮均可以明顯促進(jìn)下游信號分子CREB的磷酸化活動，從而激活了MAPK/ERK信號通路下游的CREB信號通路。而選擇性的MEK抑制劑U0126可以從MAP

14、K/ERK信號通路的上游明顯阻斷睪丸酮誘導(dǎo)的CREB磷酸化激活效應(yīng)。因此，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示睪丸酮可以激活C6細(xì)胞的MAPK/ERK/CREB細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，作為MAPK/ERK細(xì)胞信號通路的上游阻斷劑--選擇性的MEK抑制劑U0126，U0126可以明顯的以濃度依賴性方式在蛋白質(zhì)合成和基因轉(zhuǎn)錄水平上阻斷睪丸酮誘導(dǎo)的seladin-1的上調(diào)表達(dá)。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持，睪丸酮也可以通過激活C6細(xì)胞的MA

15、PK/ERK/CREB信號通路調(diào)節(jié)seladin-1基因的表達(dá)。
　　 研究結(jié)論
　　 綜上所述，我們可以認(rèn)為，雄激素具有明顯地抗Aβ25-35誘發(fā)C6細(xì)胞凋亡損害活動的神經(jīng)保護(hù)作用。雄激素可能通過上調(diào)Seladin-1基因表達(dá)而產(chǎn)生抗凋亡神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。Seladin-1基因是雄激素的一個重要的下游目標(biāo)基因。雄激素通過激活經(jīng)典的受體基因信號通路、PI3-K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路、MAPK/ERK