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文檔簡介
1、目的: 化學療法作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的術(shù)后輔助性治療,被認為有助于提高患者生存率。Tamoxifen(TAM,他莫昔芬)作為抗腫瘤藥物,廣泛應用于雌激素受體(estrogenreceptor,ER)陽性的乳腺癌的治療,近年來研究發(fā)現(xiàn),TAM也能用于ER陰性的腫瘤化療,其中包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤,但其作用機制并不十分清楚。 本課題應用TAM處理大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(C6細胞),觀察處理過程中PKCa、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的變
2、化,探討PKCα/MAPK信號的激活在TAM導致C6細胞凋亡過程中所起的作用,為臨床聯(lián)合應用相關(guān)信號抑制劑與TAM治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供一定的實驗室依據(jù)。 方法: 1.新生SD大鼠星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)、鑒定:解剖顯微鏡下分離SD大鼠大腦皮質(zhì),剪碎組織,0.25%胰酶消化;消化下來的細胞貼壁培養(yǎng)7~10d后,置于37℃恒溫搖床,250rpm搖15~18h,去除脫落細胞,繼續(xù)貼壁培養(yǎng),待細胞生長至90%融合時胰酶消化傳代;
3、 2.C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的培養(yǎng)、傳代,及生物學特性研究:C6細胞在正常培養(yǎng)條件下以含10%FBS的DMED培養(yǎng)基培養(yǎng),至90%融合時用胰酶消化,調(diào)節(jié)細胞密度為(3~5)×105/ml傳代;以細胞計數(shù)法分別計數(shù)接種0~8d的細胞數(shù),并繪制細胞生長曲線,計算細胞群體倍增時間; 3.以免疫熒光的方法檢測C6細胞與正常大鼠星形膠質(zhì)細胞中GFAP、Map2、Nestin及PKCCα的表達情況; 4.不同濃度TAM(10~30μ
4、M)處理靜息狀態(tài)的C6細胞(接種次日換用無血清培養(yǎng)基饑餓24h的細胞)經(jīng)不同時間點(0~60min),通過WesternBlot的方法觀察細胞中PKCα、ERK、JNK等磷酸化水平的變化;通過臺盼藍拒染法、DAPI染色、DNAladder、FACS等方法觀察TAM對C6細胞凋亡的影響; 5.體外培養(yǎng)的靜息狀態(tài)的C6細胞分別給予PKCα、ERK、JNK的特異性抑制劑預處理,再加入TAM,通過WesternBlot方法觀察細胞PKC
5、α、ERK、JNK等磷酸化水平的變化;通過細胞計數(shù)、FACS等方法同步觀察在各種不同抑制劑與TAM的共同作用下對C6細胞凋亡的影響。 結(jié)果: 1.體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞貼壁生長,胞體較大,有多條突起;經(jīng)機械振蕩純化的膠質(zhì)細胞,免疫熒光顯示為GFAP強陽性,Map2和Nestin陰性,PKCα弱陽性; 2.普通培養(yǎng)條件下的C6細胞貼壁生長,胞體較小,少見雙核或多核,核漿比大,有多條細長突起;體外培養(yǎng)的C6細胞7
6、天以內(nèi)均呈對數(shù)生長,細胞群體倍增時間為(19.67±0.63)h;免疫熒光顯示,C6細胞GFAP陽性,不表達Map2和Nestin;與體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞比較,C6膠質(zhì)瘤細胞中PKCα強陽性表達,定位于胞漿和突起; 3.TAM可激活C6細胞PKCα,在30μMTAM作用時間為15min時PKCα磷酸化水平明顯升高,并隨TAM作用時間的延長而增加,一直持續(xù)至1h: 4.TAM還可激活C6細胞ERK、JNK等激酶,二者
7、的磷酸化均在TAM作用時間為15min形成峰值,隨即迅速下降,而后又稍有回升; 5.TAM可引起C6細胞死亡,與TAM濃度及作用時間正相關(guān);SPSS軟件計算出其IC50值為(29.05±2.18)μM;TAM所致的C6細胞死亡以凋亡為主,表現(xiàn)為:①核形態(tài)的改變,熒光鏡下可觀察到核固縮,染色質(zhì)深染,聚集成團等典型的凋亡細胞核征象;②瓊脂糖凝膠電泳可檢測出凋亡細胞特有的DNA階梯狀片段,呈TAM濃度和時間依賴性;③PI染色后經(jīng)FAC
8、S能檢測到細胞凋亡所形成的亞二倍體凋亡峰,其峰值隨TAM作用時間的延長或TAM濃度的增加而增加; 6.PKCα的特異性抑制劑Go6976能部分抑制TAM作用過程中ERK、JNK的磷酸化增加;并增強TAM促進C6細胞凋亡的作用:當5,10,20,30μMTAM單獨作用時,C6細胞凋亡率分別為(4.56±3.95)%,(4.26±3.42)%;(30.03±11.00)%,(56.10±11.24)%,當Go6976與各濃度TAM聯(lián)
9、合作用時,細胞凋亡率分別升高至(28.52±7.81)%,(49.30±8.42)%,(63.53±13.65)%,(69.22±8.61)%: 7.ERK抑制劑PD98059和JNK抑制劑SP600125對于TAM所致的PKCα磷酸化水平增加并無明顯影響,但也能抑制TAM作用過程中ERK、JNK的磷酸化增加,同時增強TAM促進C6細胞凋亡的作用,當PD98059與各濃度TAM聯(lián)合應用時,細胞凋亡率分別為(13.52±8.26)
10、%,(19.68±8.94)%,(37.66±9.40)%,(70.80±9.09)%;當SP600125與各濃度TAM聯(lián)合應用時細胞凋亡率分別為(12.50±8.86)%,(25.00±10.67)%,(47.78±8.92)%,(74.67±9.55)%。 結(jié)論: 1.體外傳代培養(yǎng)的大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞貼壁生長,且生長迅速;保持膠質(zhì)細胞源性,不表達具有干細胞特性的Nestin或者神經(jīng)元特性的Map2:與體外培養(yǎng)的正
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