Tamoxifen誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 比較Tamoxifen(TAM，他莫昔芬)對正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6細(xì)胞)凋亡的誘導(dǎo)作用及其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用TAM提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 試驗(yàn)方法： 1.解剖顯微鏡下分離SD大鼠大腦皮質(zhì)，用胰蛋白酶對組織進(jìn)行消化，原代細(xì)胞培養(yǎng)7～10d后，37℃恒溫?fù)u床，250rpm搖15～18h，去除脫落的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，并對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定、細(xì)胞純度分析，以確定合適的傳代次數(shù)內(nèi)使用細(xì)胞。

2、 2.不同濃度TAM處理C6細(xì)胞，通過MTT法、DNA ladder法、DAPI染色以及Western Blot等方法觀察TAM對C6細(xì)胞活性、凋亡以及PKCα/βⅡ磷酸化水平的影響。 3.體外培養(yǎng)的靜息狀態(tài)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6細(xì)胞分別給予不同濃度的TAM處理，通過DNA ladder法、Western Blot等方法同步觀察TAM對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡以及PKCα/βⅡ磷酸化水平的影響。 結(jié)果：

3、 1.原代膠質(zhì)細(xì)胞取材培養(yǎng)后，利用搖床使雜細(xì)胞脫落，用GFAP免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。試驗(yàn)結(jié)果證明機(jī)械振蕩法可以純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，但隨著細(xì)胞傳代，其它的雜細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等生長迅速，使星形膠質(zhì)細(xì)胞比例下降，因此，通過此法獲得的膠質(zhì)細(xì)胞最佳使用時(shí)間是兩代以內(nèi)的細(xì)胞。 2.TAM可引起C6細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性。當(dāng)TAM濃度小于20 μM，作用24h時(shí)，C6細(xì)胞凝膠電泳未出現(xiàn)DNA階梯狀條帶

4、，當(dāng)濃度大于20 μM時(shí)，呈現(xiàn)典型的DNA階梯狀條帶，并隨濃度增加DNA階梯狀條帶變得更加明顯。與C6細(xì)胞相比，正常星形膠質(zhì)細(xì)胞組未出現(xiàn)DNA階梯狀條帶； 3.TAM可以引起C6細(xì)胞核形態(tài)的改變。經(jīng)TAM處理后，用DAPI染細(xì)胞核，當(dāng)TAM濃度大于10 μ M，作用24小時(shí)，熒光鏡下可見C6細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡特征：可見核固縮，染色質(zhì)發(fā)亮，聚集呈團(tuán)。 4.MTT法檢測結(jié)果顯示：當(dāng)TAM濃度小于20 μM時(shí)，對C6細(xì)胞活性無

5、明顯抑制作用；TAM大于20 μM時(shí)，對C6細(xì)胞活性抑制作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性。 5.Western Blot分析結(jié)果表明：TAM誘導(dǎo)C6細(xì)胞內(nèi)PKCα/βⅡ磷酸化呈時(shí)間依賴性。TAM使正常大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKCα/βⅡ均增加，但C6細(xì)胞磷酸化PKCα/βⅡ水平明顯高于正常細(xì)胞。 結(jié)論： TAM可抑制C6細(xì)胞活性和誘導(dǎo)凋亡，而PKCα/βⅡ信號傳導(dǎo)通路可能參與了TAM誘導(dǎo)的C6細(xì)胞凋亡作用