RECK在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　 骨肉瘤作為一種在兒童和年輕人中最常見的惡性骨腫瘤,血運豐富且高度惡性,預(yù)后很差。雖然已經(jīng)使用了新輔助化療和保肢手術(shù)相結(jié)合的方式,總的5年無瘤生存率仍僅有65％[1]。傳統(tǒng)的臨床預(yù)后因素雖然很好的回答臨床預(yù)后問題,但是其缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、測量方式不一致等局限性限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。隨著對腫瘤發(fā)生過程中分子路徑多樣性的認(rèn)識不斷深化,分子預(yù)后指標(biāo)逐漸成為臨床判斷預(yù)后的發(fā)展方向。其中已經(jīng)有相當(dāng)一部分(主要是P-glycop

2、rotein[2],CXCR4[3],uPA/uPAR[4]和survivin[5])已經(jīng)被證實可以很好的判斷對化療的反應(yīng)、總的預(yù)后和診斷轉(zhuǎn)移,同時也為各種新的治療藥物的產(chǎn)生提供信息和新的靶點,從而為臨床判斷臨床預(yù)后提供了新的指標(biāo)。
　　 RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif)基因是1998年Takahashi等在v-Ki-ras基因轉(zhuǎn)染的小

3、鼠的纖維原細(xì)胞(NIH3T3)表達(dá)的cDNA中分離得到的,位于人9p13-p12染色體,整個基因的長度在87kb,編碼GPI錨定糖蛋白,分子量為110kb,具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)及活性的功能,進(jìn)而能夠很好的抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。同時,RECK具有很好的抑制血管生成和成熟的作用。RECK的缺失對于小鼠胚胎發(fā)育是致命的,而金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑TIMP-1或-2的缺失幾乎無影響,這表明了在胚胎發(fā)育過程中RECK基因較任何一種TIMP

4、作用都大[7]。
　　 盡管諸多實驗已經(jīng)正式RECK有可能對惡性腫瘤的診斷及治療起著重要作用(腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等)[8],但是對于其在骨肉瘤中的表達(dá)情況卻少有報道。唯一的一項研究顯示RECK在骨肉瘤中顯示出低表達(dá),并在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用,其低表達(dá)往往預(yù)示預(yù)后不佳,同時在體外也很好的證實了具有抑制轉(zhuǎn)移的功能[9]。
　　 本項研究通過免疫組化技術(shù)檢測我院2001年2月-2005年7月

5、61例骨肉瘤組織的RECK的表達(dá)情況,并結(jié)合病人的臨床病理特點,探討RECK表達(dá)情況與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系,同時探討可能的機(jī)制,進(jìn)而為骨肉瘤的治療方法的選擇提供依據(jù),也為各種新的骨肉瘤治療藥物的產(chǎn)生提供信息和新的靶點。
　　 目的：
　　 1.探討RECK在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況；
　　 2.探討RECK表達(dá)與骨肉瘤預(yù)后之間的關(guān)系:
　　 材料與方法
　　 1.病例資料
　　 病例資料均取自我

6、院骨科2001年2月-2005年7月術(shù)中切取的經(jīng)我院病理科明確診斷為骨肉瘤的病人。其中男性42例,女性19例；年齡4-53歲,平均年齡21.4歲。其中病變部位位于股骨遠(yuǎn)端28例:脛骨近端30例；肱骨近端1例；腓骨近端1例；骨盆1例。
　　 所有病人在術(shù)前均接受了術(shù)前2次化療和術(shù)后6次化療治療?；煼桨竻⒄誘12方案,簡單的概括為:每個周期的化療包括高劑量的甲氨喋呤、阿霉素、順鉑、異環(huán)磷酰胺。
　　 隨訪周期定義為首發(fā)癥狀

7、到死亡或者最后一次隨訪的間隔時間。隨訪周期為8-104月。
　　 1.1病例入選標(biāo)準(zhǔn)
　　 1)肢體惡性骨肉瘤；
　　 2)首發(fā)時均無轉(zhuǎn)移灶；
　　 3)沒有先前治療病史；
　　 4)術(shù)前、術(shù)后均接受了完整化療治療；
　　 5)均接受了廣泛或根治性切除術(shù):
　　 6)所切取的標(biāo)本均可以用于免疫組化檢測。
　　 1.2病例排除標(biāo)準(zhǔn)
　　 1)未接受全程標(biāo)準(zhǔn)化治療的患者

8、
　　 2)化療前胸部平片證實有肺轉(zhuǎn)移者
　　 3)接受化療后因化療副反應(yīng)而終止治療者
　　 4)未完成標(biāo)準(zhǔn)化療治療的患者
　　 2.主要試劑及工作濃度
　　 2.1 RECK
　　 兔抗人多克隆抗體,H-300,Santa Cruze公司,工作濃度為1:502.2抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(ChemMateTMEn Visio+/HRP/DABRb&Mc)DAKO公司產(chǎn)品
　

9、　 2.3.1適用性
　　 一抗為兔抗或鼠抗的免疫組化檢測
　　 2.3.2原理
　　 試劑盒是一個特別敏感的二步法免疫組化試劑盒,適合于兔抗抗體或鼠抗抗體配用。其中ChemMateTMEn Visio是標(biāo)記有HRP(辣根過氧化物酶)和抗兔及抗鼠免疫球蛋白的多具體分子,相當(dāng)于二抗,它與兔抗或鼠抗-抗結(jié)合。結(jié)合后的大分子即標(biāo)記偶辣根過氧化物酶,再與DAB(3,3,-二氨基聯(lián)苯胺)反應(yīng),得到棕色顯色。由于該系統(tǒng)不含

10、有生物素和鏈親和素,所以不受內(nèi)源性生物素干擾。染色背景非常清晰。
　　 3.免疫組化方法
　　 3.1組織切片、烤片
　　 每例骨肉瘤組織石蠟標(biāo)本連續(xù)切片3張,厚4-μm,在60℃烤箱中烘烤1-2小時
　　 3.2切片脫蠟水化
　　 將厚度為4-μm已在烤箱中干燥后的石蠟切片浸于二甲苯中10分鐘,三次。取出切片置于100％無水乙醇中10分鐘兩次,一次置入90％-70％各級酒精各10分鐘。取出置于蒸

11、餾水中水洗。
　　 3.3抗原修復(fù)
　　 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法:將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內(nèi),使切片位于液面一下,蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5-6分鐘后),及時1-2分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋取出切片,置于蒸餾水中洗。
　　 3.4過氧化物酶阻斷
　　 Quechua蒸餾水中的

12、切片,甩掉并擦干切片組織周圍的液體,平放于濕盒中,滴加過氧化物酶阻斷劑(3％過氧化氫)于組織上避光孵育5-20分鐘。蒸餾水沖洗,再將切片置入PBS緩沖液中,浸泡5分鐘,三次。取出切片,甩掉并擦干組織周圍的液體,平放于濕盒中。
　　 3.5滴加一抗
　　 滴加50-100微升一抗工作液于組織上,室溫孵育30分鐘。用PBS液沖洗切片。將切片置于PBS緩沖液中,浸泡5分鐘,三次。取出切片。甩掉并擦干組織周圍的液體,平放于濕盒中

13、。
　　 3.6滴加二抗(ChemMate TMEn Visio+/HRP)
　　 滴加50-100微升A液(ChemMateTMEnVisio+/HRP)于組織上,室溫孵育30分鐘。用PBS液沖洗切片。將切片置于PBS緩沖液中,浸泡5分鐘,三次。取出切片,甩掉并擦干組織周圍的液體,平放于濕盒中。
　　 3.7滴加顯色劑(DAB)
　　 滴加預(yù)先準(zhǔn)備好的顯色劑DAB工作液50-100微升,孵育2-30分鐘

14、,在光學(xué)顯微鏡下控制顯色,顯色完全后,用蒸餾水沖洗終止顯色。
　　 3.8復(fù)染、脫水、封片
　　 用蘇木精復(fù)染。各級酒精(70-100％)脫水,每級10分鐘。取出切片置入二甲苯10分鐘,三次。用中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。
　　 4.RECK在骨肉瘤組織中的表達(dá)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
　　 RECK蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒樣物質(zhì),位于細(xì)胞漿內(nèi)。高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野(每個視野觀

15、察細(xì)胞數(shù)不少于200個),按陽性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。采用9分評分制:按照陽性細(xì)胞比例:無染色0分
　　 ≤10％為1分,
　　 10％～50％為2分,
　　 >50％為3分；
　　 按染色強(qiáng)弱:陰性為0分；
　　 淡黃色染色為1分；
　　 中度黃色染色為2分,
　　 棕黃色染色<為3分。
　　 基于此,計算兩種評分系統(tǒng)的得分總和,總分≤4為陰性組,總分>4

16、為陽性組[10].
　　 5 統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,各組之間陽性表達(dá)率比較用x2檢驗。用Kaplan-Meier方法計算生存率,組間生存率的比較采用log-rank檢驗。通過單因素分析檢測可能的臨床預(yù)后因素,并通過COX回歸分析(采用逐步回歸法,納入變量的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05,剔除標(biāo)準(zhǔn)為P>o.10)進(jìn)一步檢測預(yù)后的影響因子。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05.
　　 6.結(jié)果

17、　　 6.1 RECK在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況
　　 在骨肉瘤組織中,RECK主要表現(xiàn)為在骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)為棕黃色大小不等的顆粒樣物質(zhì)。
　　 6.2 RECK與臨床相關(guān)特點之間的關(guān)系
　　 基于RECK表達(dá)的比例及密度評分的綜合,將病人分為陽性表達(dá)組34人(55.7％),陰性表達(dá)組27人(44.3％)。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)RECK表達(dá)與轉(zhuǎn)移p=0.003)及復(fù)發(fā)(P=0.001)有明顯相關(guān)性,而與年齡、性

18、別、腫瘤部位及分型未見明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.3 RECK與臨床預(yù)后及生存率之間的關(guān)系
　　 單因素分析顯示RECK表達(dá)與是否轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、Ennecking分期及細(xì)胞壞死率有關(guān)。RECK陽性組生存率為82.4％,明顯高于RECK陰性表達(dá)組(29.6％；P=.000)。為了確切評估RECK對骨肉瘤預(yù)后的作用,采用多因素分析可能有意義的變量。研究發(fā)現(xiàn)RECK表達(dá)可以作為骨肉瘤預(yù)后的一個獨立預(yù)后因素(P=.006；HR,0