甲醇中毒視網(wǎng)膜功能結構和蛋白質組學研究.pdf

1、甲醇是重要的化工原料和有機溶劑，是工業(yè)用酒精的主要成分之一，由于其價格低廉、來源廣泛，且具有微弱的乙醇香味，時常被一些不法分子用于制造假酒，引起群體性中毒事件并造成惡劣的社會影響；在生活和生產(chǎn)中，通過皮膚接觸或是呼吸道吸入致甲醇急慢性中毒的案例也時有發(fā)生。急性中毒多因誤服甲醇代替乙醇作為飲料所致，由于多數(shù)患者不會意識到飲用假酒這一事實，臨床診斷和治療往往不夠及時和準確，甚至于漏診，以至于造成極其嚴重的后果。中毒者以視力障礙和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀

2、較為突出，嚴重者甚至于死亡，并且即使經(jīng)過搶救等及時治療，視力障礙也通常難以完全恢復。因甲醇中毒死亡或致殘的，多會釀成嚴重的刑事案件或民事糾紛。中毒后幸存者往往需要鑒定損傷程度和傷殘等級的評定，有時也會涉及中毒與不良后果之間因果關系的鑒定，其中又常涉及視覺功能檢驗，這就需要我們對甲醇中毒對視網(wǎng)膜的毒性作用和損害機制有全面、深入的了解。
　　 作為甲醇毒性的一個重要靶器官，視網(wǎng)膜的宏觀功能、微觀結構、分子組成等方面在甲醇的毒性作用下

3、都會發(fā)生一定改變。視網(wǎng)膜電圖作為視網(wǎng)膜功能的客觀檢測方法之一，在臨床上被廣泛作為視網(wǎng)膜疾病與視網(wǎng)膜損傷的診斷和治療依據(jù)。由于視網(wǎng)膜電圖各波形可以反應視網(wǎng)膜不同細胞的生物電活動，所以視網(wǎng)膜電圖不僅可用于評估甲醇對視網(wǎng)膜造成的宏觀功能損害，而且可以在細胞層面反映視網(wǎng)膜不同細胞的受損情況。
　　 近年來蛋白質組學逐漸在毒理學研究方面嶄露頭角，作為高通量的蛋白質研究方法，其不僅可用于篩選生物學標志物，也可為毒理學作用機制的研究提供新的方

4、法。本課題在原有研究基礎和研究方法上，將研究甲醇對視網(wǎng)膜功能、形態(tài)以及蛋白質分子的毒性作用，并探討甲醇對視網(wǎng)膜的毒性作用機制。主要的研究內容為以下6個部分：
　　 第一部分甲醇中毒視網(wǎng)膜功能改變研究
　　 為研究不同甲醇劑量和不同毒性作用時間下的視網(wǎng)膜功能，建立了甲醇中毒的實驗大鼠模型(FR大鼠)，并依據(jù)給毒劑量和毒性作用時間分為中毒劑量3天組，中毒劑量7天組和低劑量3天組、低劑量7天組。依據(jù)ISCEV(Internat

5、ionalSociety for Clinical Electrophysiology of Vision)規(guī)定方法，分別在暗視和明視狀態(tài)下進行大鼠視網(wǎng)膜電圖的檢測，結合統(tǒng)計學方法研究甲醇對視網(wǎng)膜視桿細胞反應、最大混合反應和視錐細胞反應的影響。研究發(fā)現(xiàn)：甲醇毒性致視網(wǎng)膜功能呈現(xiàn)不同程度下降，中毒劑量甲醇對明視、暗視系統(tǒng)損害都較大，暗視系統(tǒng)損害較重呈現(xiàn)進行性下降，而明視系統(tǒng)損害進展緩慢。較低劑量的甲醇會造成以暗視系統(tǒng)為主的一過性損害。

6、r>　　 第二部分視網(wǎng)膜與肝腎等代謝相關組織病理形態(tài)學改變研究
　　 為了研究視網(wǎng)膜在甲醇毒性作用下的組織學改變，以及組織結構隨時間改變的特征，我們特取視網(wǎng)膜組織進行光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察其顯微結構和超微結構變化。同時取部分肝腎組織進行組織學比較研究，以研究視網(wǎng)膜對甲醇毒性的敏感性。組織經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片、染色等流程，在光學顯微鏡下視網(wǎng)膜呈現(xiàn)細胞水腫和組織疏松，以外層視網(wǎng)膜為甚。透射電子顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)線粒體水腫

7、、空泡、嵴斷裂等表現(xiàn)。但不同劑量和不同毒性作用時間下的視網(wǎng)膜結構改變特點有所不同：中毒劑量的甲醇會造成光感受器和內核層細胞組織形態(tài)的改變，并且隨中毒時間延長組織學改變有加重趨勢；光感受器的線粒體損害早于內核層線粒體損害的發(fā)生；低劑量甲醇對視網(wǎng)膜組織結構的毒性作用是可逆的；視網(wǎng)膜較其他器官對甲醇更為敏感。
　　 第三部分甲醇血濃度的檢測與分析
　　 為研究甲醇的代謝情況，利用頂空氣相色譜法檢測各組實驗動物血中的甲醇濃度。頂

8、空氣相色譜法是一種可穩(wěn)定準確檢測血甲醇的定性定量方法。將各組實驗動物引頸處死后，取心血及時保存于EDTA抗凝管中，將1uL的血樣與500uL叔丁醇混合，直接進入頂空進樣器，每個樣本經(jīng)檢測器FID1A和FID2B檢查兩次。研究發(fā)現(xiàn)甲醇的保留時間為1.134min；中毒劑量的甲醇在給藥7天后仍可被檢測到，說明甲醇在體內代謝緩慢，存在一定蓄積性。
　　 第四部分甲醇中毒視網(wǎng)膜蛋白質組學研究
　　 為研究甲醇中毒后視網(wǎng)膜蛋白質組

9、學的變化，提取臨床中毒癥狀和視網(wǎng)膜功能障礙最嚴重的中毒劑量7天組和對正常對照組的視網(wǎng)膜蛋白質并定量，經(jīng)過雙向凝膠電泳分離、凝膠染色和圖像采集分析，認定灰度相差3倍以上為的蛋白質為差異蛋白，并膠上酶解差異蛋白，經(jīng)過MALDI-TOF-TOF MS質譜鑒定，成功篩選出24個差異蛋白質，其中上調的蛋白包括14個，如aldehydedehydrogenase，tropomyosin alpha-1 chain，myosin light chai

10、n MLC1，myosinregulatory light chain2，actin gamma1 propeptide-like，myosin light chain MLC3，alpha-crystalline A chain(2 spots)，alpha-crystalline B chain(3spots)，beta-crystallineA2，beta-crystalline B2，and beta-crystalline B

11、3.下調的蛋白包括10個，如heatshock protein60，actin cytoplasmic1，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，tubulin beta-2A chain，recoverin，synuclein Beta，Chain A Calmodulin，ATP synthase(H+transporting，mitochondrial F1 complex，alpha s

12、ubunit)，ATP synthase subunitalpha，zero beta-globin.α晶狀體蛋白B經(jīng)western blot驗證確系明顯上調。
　　 差異蛋白種類和功能涉及到細胞骨架相關蛋白、與代謝及線粒體功能相關蛋白、視網(wǎng)膜特有結構和功能蛋白。從毒性反應分析，甲醇對視網(wǎng)膜蛋白質造成的影響一方面在于甲醇及其代謝物對視網(wǎng)膜組織蛋白的直接毒性作用，包括對細胞骨架相關蛋白和對線粒體功能相關蛋白的損害；另一方面的影響在

13、于引發(fā)視網(wǎng)膜自身對毒性作用所做出的保護性反應，如晶體蛋白的分子伴侶功能。
　　 第五部分差異性蛋白的亞細胞定位
　　 為研究差異性蛋白質的亞細胞定位，采用LOCtree在線服務軟件，輸入24個差異性蛋白質的氨基酸序列，得到每個蛋白質的亞細胞定位信息。其中位于細胞胞漿的蛋白質最多，高達75％，其次是線粒體16.67％，位于細胞外以及與DNA結合的蛋白質均為4.17％。亞細胞定位信息提示除線粒體功能障礙這一經(jīng)典作用途徑外，可

14、能存在線粒體外的其他作用機制，或是多條途徑相互影響的情況。
　　 第六部分構建甲醇中毒視網(wǎng)膜差異性蛋白質基因間的信號轉導網(wǎng)絡
　　 為研究差異性蛋白間潛在的信號關聯(lián)和中毒機制，基于KEGG數(shù)據(jù)庫，在數(shù)據(jù)庫中搜索滿足篩選條件基因的上游和下游基因，之后根據(jù)基因與其上、下游相互作用關系畫出基因間連接線。分析發(fā)現(xiàn)，ATP5A1(ATP合成酶基因)是中介能力最強的基因；與ATP5A1相互作用的基因數(shù)目最多為高達40個，所以ATP5

15、A1在整個Signal-Net中處于一個關鍵節(jié)點的位置；位于ATP5A1的下游基因包括細胞骨架蛋白、甲醛脫氫酶以及晶體蛋白。再次提示線粒體是重要的中介部位，甲醇可能除了直接影響線粒體代謝而導致視網(wǎng)膜損害外，還對位于線粒體中的ATP合成酶的改變進而影響到其下游的細胞骨架蛋白、甲醛脫氫酶、以及晶體蛋白等的調節(jié)和功能。
　　 小結
　　 通過對視網(wǎng)膜功能和結構的影響，發(fā)現(xiàn)了不同劑量和不同中毒時間的甲醇對視網(wǎng)膜功能和形態(tài)結構的影

16、響不同，甲醇對內核層和光感受器細胞均有損害，光感受器細胞線粒體損害早于內核層線粒體的損害，視桿細胞較視錐細胞對甲醇更為敏感；運用頂空氣相色譜法，確證了甲醇在體內代謝緩慢情況，并發(fā)現(xiàn)甲醇濃度的降低不會終止視網(wǎng)膜功能和結構的進一步惡化；通過對甲醇中毒后視網(wǎng)膜蛋白質組學的研究，首次篩選出了甲醇對視網(wǎng)膜毒性作用的候選生物學標志物；通過對差異性蛋白的亞細胞定位研究和構建差異蛋白質的信號轉導網(wǎng)絡，提示線粒體處于甲醇毒性機制的中心位置外，存在線粒體外