甲醇中毒視網(wǎng)膜功能結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、甲醇是重要的化工原料和有機(jī)溶劑，是工業(yè)用酒精的主要成分之一，由于其價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛，且具有微弱的乙醇香味，時(shí)常被一些不法分子用于制造假酒，引起群體性中毒事件并造成惡劣的社會(huì)影響；在生活和生產(chǎn)中，通過(guò)皮膚接觸或是呼吸道吸入致甲醇急慢性中毒的案例也時(shí)有發(fā)生。急性中毒多因誤服甲醇代替乙醇作為飲料所致，由于多數(shù)患者不會(huì)意識(shí)到飲用假酒這一事實(shí)，臨床診斷和治療往往不夠及時(shí)和準(zhǔn)確，甚至于漏診，以至于造成極其嚴(yán)重的后果。中毒者以視力障礙和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀

2、較為突出，嚴(yán)重者甚至于死亡，并且即使經(jīng)過(guò)搶救等及時(shí)治療，視力障礙也通常難以完全恢復(fù)。因甲醇中毒死亡或致殘的，多會(huì)釀成嚴(yán)重的刑事案件或民事糾紛。中毒后幸存者往往需要鑒定損傷程度和傷殘等級(jí)的評(píng)定，有時(shí)也會(huì)涉及中毒與不良后果之間因果關(guān)系的鑒定，其中又常涉及視覺(jué)功能檢驗(yàn)，這就需要我們對(duì)甲醇中毒對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用和損害機(jī)制有全面、深入的了解。
　　 作為甲醇毒性的一個(gè)重要靶器官，視網(wǎng)膜的宏觀功能、微觀結(jié)構(gòu)、分子組成等方面在甲醇的毒性作用下

3、都會(huì)發(fā)生一定改變。視網(wǎng)膜電圖作為視網(wǎng)膜功能的客觀檢測(cè)方法之一，在臨床上被廣泛作為視網(wǎng)膜疾病與視網(wǎng)膜損傷的診斷和治療依據(jù)。由于視網(wǎng)膜電圖各波形可以反應(yīng)視網(wǎng)膜不同細(xì)胞的生物電活動(dòng)，所以視網(wǎng)膜電圖不僅可用于評(píng)估甲醇對(duì)視網(wǎng)膜造成的宏觀功能損害，而且可以在細(xì)胞層面反映視網(wǎng)膜不同細(xì)胞的受損情況。
　　 近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸在毒理學(xué)研究方面嶄露頭角，作為高通量的蛋白質(zhì)研究方法，其不僅可用于篩選生物學(xué)標(biāo)志物，也可為毒理學(xué)作用機(jī)制的研究提供新的方

4、法。本課題在原有研究基礎(chǔ)和研究方法上，將研究甲醇對(duì)視網(wǎng)膜功能、形態(tài)以及蛋白質(zhì)分子的毒性作用，并探討甲醇對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用機(jī)制。主要的研究?jī)?nèi)容為以下6個(gè)部分：
　　 第一部分甲醇中毒視網(wǎng)膜功能改變研究
　　 為研究不同甲醇劑量和不同毒性作用時(shí)間下的視網(wǎng)膜功能，建立了甲醇中毒的實(shí)驗(yàn)大鼠模型(FR大鼠)，并依據(jù)給毒劑量和毒性作用時(shí)間分為中毒劑量3天組，中毒劑量7天組和低劑量3天組、低劑量7天組。依據(jù)ISCEV(Internat

5、ionalSociety for Clinical Electrophysiology of Vision)規(guī)定方法，分別在暗視和明視狀態(tài)下進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜電圖的檢測(cè)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究甲醇對(duì)視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞反應(yīng)、最大混合反應(yīng)和視錐細(xì)胞反應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)：甲醇毒性致視網(wǎng)膜功能呈現(xiàn)不同程度下降，中毒劑量甲醇對(duì)明視、暗視系統(tǒng)損害都較大，暗視系統(tǒng)損害較重呈現(xiàn)進(jìn)行性下降，而明視系統(tǒng)損害進(jìn)展緩慢。較低劑量的甲醇會(huì)造成以暗視系統(tǒng)為主的一過(guò)性損害。

6、r>　　 第二部分視網(wǎng)膜與肝腎等代謝相關(guān)組織病理形態(tài)學(xué)改變研究
　　 為了研究視網(wǎng)膜在甲醇毒性作用下的組織學(xué)改變，以及組織結(jié)構(gòu)隨時(shí)間改變的特征，我們特取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)變化。同時(shí)取部分肝腎組織進(jìn)行組織學(xué)比較研究，以研究視網(wǎng)膜對(duì)甲醇毒性的敏感性。組織經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋、切片、染色等流程，在光學(xué)顯微鏡下視網(wǎng)膜呈現(xiàn)細(xì)胞水腫和組織疏松，以外層視網(wǎng)膜為甚。透射電子顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)線粒體水腫

7、、空泡、嵴斷裂等表現(xiàn)。但不同劑量和不同毒性作用時(shí)間下的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變特點(diǎn)有所不同：中毒劑量的甲醇會(huì)造成光感受器和內(nèi)核層細(xì)胞組織形態(tài)的改變，并且隨中毒時(shí)間延長(zhǎng)組織學(xué)改變有加重趨勢(shì)；光感受器的線粒體損害早于內(nèi)核層線粒體損害的發(fā)生；低劑量甲醇對(duì)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的毒性作用是可逆的；視網(wǎng)膜較其他器官對(duì)甲醇更為敏感。
　　 第三部分甲醇血濃度的檢測(cè)與分析
　　 為研究甲醇的代謝情況，利用頂空氣相色譜法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血中的甲醇濃度。頂

8、空氣相色譜法是一種可穩(wěn)定準(zhǔn)確檢測(cè)血甲醇的定性定量方法。將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引頸處死后，取心血及時(shí)保存于EDTA抗凝管中，將1uL的血樣與500uL叔丁醇混合，直接進(jìn)入頂空進(jìn)樣器，每個(gè)樣本經(jīng)檢測(cè)器FID1A和FID2B檢查兩次。研究發(fā)現(xiàn)甲醇的保留時(shí)間為1.134min；中毒劑量的甲醇在給藥7天后仍可被檢測(cè)到，說(shuō)明甲醇在體內(nèi)代謝緩慢，存在一定蓄積性。
　　 第四部分甲醇中毒視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 為研究甲醇中毒后視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組

9、學(xué)的變化，提取臨床中毒癥狀和視網(wǎng)膜功能障礙最嚴(yán)重的中毒劑量7天組和對(duì)正常對(duì)照組的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)并定量，經(jīng)過(guò)雙向凝膠電泳分離、凝膠染色和圖像采集分析，認(rèn)定灰度相差3倍以上為的蛋白質(zhì)為差異蛋白，并膠上酶解差異蛋白，經(jīng)過(guò)MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜鑒定，成功篩選出24個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中上調(diào)的蛋白包括14個(gè)，如aldehydedehydrogenase，tropomyosin alpha-1 chain，myosin light chai

10、n MLC1，myosinregulatory light chain2，actin gamma1 propeptide-like，myosin light chain MLC3，alpha-crystalline A chain(2 spots)，alpha-crystalline B chain(3spots)，beta-crystallineA2，beta-crystalline B2，and beta-crystalline B

11、3.下調(diào)的蛋白包括10個(gè)，如heatshock protein60，actin cytoplasmic1，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，tubulin beta-2A chain，recoverin，synuclein Beta，Chain A Calmodulin，ATP synthase(H+transporting，mitochondrial F1 complex，alpha s

12、ubunit)，ATP synthase subunitalpha，zero beta-globin.α晶狀體蛋白B經(jīng)western blot驗(yàn)證確系明顯上調(diào)。
　　 差異蛋白種類和功能涉及到細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、與代謝及線粒體功能相關(guān)蛋白、視網(wǎng)膜特有結(jié)構(gòu)和功能蛋白。從毒性反應(yīng)分析，甲醇對(duì)視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)造成的影響一方面在于甲醇及其代謝物對(duì)視網(wǎng)膜組織蛋白的直接毒性作用，包括對(duì)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和對(duì)線粒體功能相關(guān)蛋白的損害；另一方面的影響在

13、于引發(fā)視網(wǎng)膜自身對(duì)毒性作用所做出的保護(hù)性反應(yīng)，如晶體蛋白的分子伴侶功能。
　　 第五部分差異性蛋白的亞細(xì)胞定位
　　 為研究差異性蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，采用LOCtree在線服務(wù)軟件，輸入24個(gè)差異性蛋白質(zhì)的氨基酸序列，得到每個(gè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息。其中位于細(xì)胞胞漿的蛋白質(zhì)最多，高達(dá)75％，其次是線粒體16.67％，位于細(xì)胞外以及與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)均為4.17％。亞細(xì)胞定位信息提示除線粒體功能障礙這一經(jīng)典作用途徑外，可

14、能存在線粒體外的其他作用機(jī)制，或是多條途徑相互影響的情況。
　　 第六部分構(gòu)建甲醇中毒視網(wǎng)膜差異性蛋白質(zhì)基因間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)
　　 為研究差異性蛋白間潛在的信號(hào)關(guān)聯(lián)和中毒機(jī)制，基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索滿足篩選條件基因的上游和下游基因，之后根據(jù)基因與其上、下游相互作用關(guān)系畫出基因間連接線。分析發(fā)現(xiàn)，ATP5A1(ATP合成酶基因)是中介能力最強(qiáng)的基因；與ATP5A1相互作用的基因數(shù)目最多為高達(dá)40個(gè)，所以ATP5

15、A1在整個(gè)Signal-Net中處于一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的位置；位于ATP5A1的下游基因包括細(xì)胞骨架蛋白、甲醛脫氫酶以及晶體蛋白。再次提示線粒體是重要的中介部位，甲醇可能除了直接影響線粒體代謝而導(dǎo)致視網(wǎng)膜損害外，還對(duì)位于線粒體中的ATP合成酶的改變進(jìn)而影響到其下游的細(xì)胞骨架蛋白、甲醛脫氫酶、以及晶體蛋白等的調(diào)節(jié)和功能。
　　 小結(jié)
　　 通過(guò)對(duì)視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)了不同劑量和不同中毒時(shí)間的甲醇對(duì)視網(wǎng)膜功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影

16、響不同，甲醇對(duì)內(nèi)核層和光感受器細(xì)胞均有損害，光感受器細(xì)胞線粒體損害早于內(nèi)核層線粒體的損害，視桿細(xì)胞較視錐細(xì)胞對(duì)甲醇更為敏感；運(yùn)用頂空氣相色譜法，確證了甲醇在體內(nèi)代謝緩慢情況，并發(fā)現(xiàn)甲醇濃度的降低不會(huì)終止視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步惡化；通過(guò)對(duì)甲醇中毒后視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，首次篩選出了甲醇對(duì)視網(wǎng)膜毒性作用的候選生物學(xué)標(biāo)志物；通過(guò)對(duì)差異性蛋白的亞細(xì)胞定位研究和構(gòu)建差異蛋白質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，提示線粒體處于甲醇毒性機(jī)制的中心位置外，存在線粒體外