攜帶抗氧化基因的BMSCs對PQ所致小鼠肺損傷作用的研究.pdf

1、目的:
　　通過構(gòu)建百草枯所致的小鼠肺損傷模型，研究骨髓間充質(zhì)干細胞及攜帶有抗氧化基因Nrf2、SOD的骨髓間充質(zhì)干細胞對其的治療作用及可能機制。
　　方法:
　　第—部分:
　　構(gòu)建攜帶有Nrf2和SOD基因的過表達慢病毒并進行相關(guān)鑒定;培養(yǎng)、驗證小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞;利用過表達抗氧化基因的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，建立攜帶有抗氧化基因(Nrf2、SOD)的BMSCs體系，并利用報告基因表達的櫻桃紅色熒光對其轉(zhuǎn)染率

2、進行鑒定，Western blot檢測其蛋白水平的表達情況。
　　第二部分:
　　按照第一部分的方法大量培養(yǎng)BMSCs細胞體系、攜帶有空載基因的BMSC細胞體系、攜帶有抗氧化基因(Nrf2、SOD)的BMSCs細胞體系等4組細胞體系作為治療組;清潔級balb/c小鼠144只隨機分為6組，每組24只:百草枯中毒組、BMSCs治療組、攜帶空載基因的BMSCs治療組、攜帶Nrf2基因的BMSCs治療組、攜帶SOD基因的BMSCs治

3、療組和正常組。一次性腹腔注射百草枯溶液（25mg/Kg）構(gòu)建小鼠百草枯中毒肺損傷模型，正常組給予等體積生理鹽水;在注射百草枯溶液后4小時給予相應(yīng)組別球后靜脈注射相應(yīng)的細胞體系;觀察各組小鼠經(jīng)不同處理方法后的行為學(xué)改變;分別在給予細胞治療后的3、7、14、21天處死各組小鼠取相應(yīng)肺組織標(biāo)本，行HE染色病理組織學(xué)觀察，電鏡觀察超顯微結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)損傷情況，Tunel技術(shù)觀察肺組織凋亡情況，留取血液標(biāo)本，用化學(xué)比色法檢測SOD、MDA、GSH等相應(yīng)

4、的氧化應(yīng)激指標(biāo)，制備肺組織勻漿，用ELISA方法檢測IL-1β、TNF-α、TGF-β等炎癥指標(biāo)，用Western Blot檢測肺組織核磷酸化NF-κB亞基(P-p65)的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光表達情況，攜帶有抗氧化基因(Nrf2、SOD)的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染率均達80％以上，Lv-Nrf2及Lv-SOD轉(zhuǎn)染BMSCs后，通過Western blot檢測其在BMSCs中實現(xiàn)了蛋白表

5、達量明顯升高(P＜0.05)。
　　2.PQ中毒后，小鼠早期便出現(xiàn)了出現(xiàn)食欲下降、體重減輕、倦怠少動，反應(yīng)遲緩，毛色干枯，呼吸急促等表現(xiàn);但實施了BMSCs、攜帶有空載基因的BMSCs、攜帶有Nrf2基因的BMSCs及攜帶有SOD基因的BMSCs靜脈注射的小鼠上訴癥狀得到了明顯改善。無論是干細胞還是抗氧化基因的作用，都可能對百草枯所致的肺損傷有治療作用;
　　3.肺組織病理學(xué)結(jié)合電鏡觀察顯示，與百草枯中毒組相比，實施了BMS

6、Cs、攜帶有空載基因的BMSCs、攜帶有Nrf2基因的BMSCs及攜帶有SOD基因的BMSCs靜脈注射的小鼠肺組織損傷程度大大減輕(P＜0.05)，而且攜帶有Nrf2基因的BMSCs的治療效果更好(P＜0.05)。
　　4.TUNEL檢測結(jié)果顯示，與百草枯中毒組相比，實施了BMSCs、攜帶有空載基因的BMSCs、攜帶有Nrf2基因的BMSCs及攜帶有SOD基因的BMSCs靜脈注射的小鼠肺組織的凋亡細胞陽性染色率明顯降低(P＜0.0

7、5)，并且攜帶有Nrf2基因的BMSCs小鼠肺組織的凋亡細胞陽性染色率低于其他組別（PQ+BMSCs組、PQ+攜帶有空載基因的BMSCs組、PQ+攜帶有SOD基因的BMSCs組）。
　　5.Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，PQ中毒時，Nrf2在第3天，第21天都有高表達(P＜0.05)，SOD在第3天有高表達(P＜0.05)，在第21天時其表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與PQ中毒組相比，經(jīng)BMSCs、攜帶有空

8、載基因的BMSCs、攜帶有Nrf2基因的BMSCs及攜帶有SOD基因的BMSCs治療Nrf2、蛋白表達量在第3、21天都有升高(P＜0.05)，經(jīng)BMSCs、攜帶有空載基因的BMSCs、攜帶有Nrf2基因的BMSCs治療的SOD蛋白表達量在第3天有升高(P＜0.05)，第21天時已經(jīng)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，但經(jīng)攜帶有SOD基因的BMSCs治療組在第3、21天SOD蛋白都有升高(P＜0.05);與BMSCs、攜帶有SOD基因的BMS

9、Cs治療組相比，攜帶有Nrf2基因的BMSCs治療組Nrf2蛋白表達量更高(P＜0.05)。
　　6.化學(xué)比色結(jié)果顯示，與正常組相比，PQ中毒時MDA水平上升，SOD、GSH水平下降(P＜0.05)，而且在第3天、第7天大幅變動，之后隨著時間延長不再出現(xiàn)趨勢變動;BMSCs能在早期抑制這種趨勢的發(fā)生(P＜0.05)，BMSCs與Nrf2的結(jié)合作用更具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　7.ELISA結(jié)果顯示，與正常組組比較，

10、PQ組3d時TNF-α、IL-1β、IL-6明顯升高(P＜0.05)，但隨時間推移其變化不再明顯;與PQ中毒組比較，BMSCs治療組、攜帶Nrf2基因的BMSCs系治療組、攜帶SOD基因的BMSCs系治療組能緩解其上升幅度(P＜0.05)。BMSCs組和攜帶Nrf2基因的BMSCs系治療組兩者之間對TNF-α、IL-1β指標(biāo)的影響在3、7、14天，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，BMSCs組和攜帶SOD基因的BMSCs系治療組兩者之間對

11、TNF-α、IL-1β指標(biāo)的影響在3、7、14天，無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　8.Western Blot檢測肺組織核磷酸化NF-κB亞基(P-p65)結(jié)果顯示，與正常組比較，PQ中毒后P-p65表達量在第3、7天顯著升高(P＜0.05);與百草枯中毒組比較，經(jīng)BMSCs、攜帶有空載基因的BMSCs、攜帶有Nrf2基因的BMSCs及攜帶有SOD基因的BMSCs治療的P-p65表達量在第3、7、14天有下降(P＜0.05)，并且攜帶有Nrf