sRAGE對(duì)脂多糖介導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用.pdf

1、急性肺損傷(Acute Lung Injury, ALI)及其嚴(yán)重表現(xiàn)--急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是威脅生命的嚴(yán)重疾患，臨床上以膿毒癥引起的內(nèi)毒素肺損傷最為常見。針對(duì)膿毒癥早期炎癥介質(zhì)釋放，人們嘗試應(yīng)用各種抗炎性因子治療，但其較高的發(fā)病率與病死率一直無法得到有效控制。近年來，高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)作為

2、內(nèi)毒素/脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)致死效應(yīng)的重要晚期因子備受關(guān)注，新近研究表明，即使在“早期”炎癥介質(zhì)釋放之后應(yīng)用抗HMGB1抗體，仍可對(duì)致命性急性肺損傷動(dòng)物發(fā)揮保護(hù)作用，這為臨床治療提供了更寬的時(shí)間窗。 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation End-Products，PAGE)是介導(dǎo)HMGB1細(xì)胞因子活性的重要受體。除了HMGB1，其配體還包括糖基化

3、終末產(chǎn)物、β淀粉樣肽、S100蛋白等。RAGE與其配體相互作用常導(dǎo)致快速持續(xù)的細(xì)胞活化和下游基因轉(zhuǎn)錄，多種細(xì)胞信號(hào)ERK1/2(p44/p42)、p38 andSAPK/JNK MAP kinases，rho-GTPases，phosphoinositol-3-kinase，and the JAK/STAT在不同類型細(xì)胞中被激活，并通過核因子-kappaB(Nuclear Factor-kappaB，NF-кB)持久活化維持和擴(kuò)大炎癥反

4、應(yīng)。有報(bào)道指出，RAGE敲除小鼠能耐受盲腸結(jié)扎穿孔引起的感染性休克，表明RAGE在系統(tǒng)性急性炎癥過程中發(fā)揮重要作用。 最近，在人類和小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)幾種RAGE的變異體，公認(rèn)的有可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)和內(nèi)源性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE，esRAGE)。雖然它們的產(chǎn)生機(jī)制及分子大小不盡相同，但由于都包括配體結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)域而缺乏跨膜區(qū)域，因此能與RAGE競爭同RA

5、GE配體的結(jié)合，并阻斷RAGE信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。體內(nèi)外研究證實(shí)，應(yīng)用sRAGE對(duì)糖尿病血管病變、創(chuàng)口延遲愈合、遲發(fā)型高敏反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎等多種炎癥性疾病動(dòng)物模型具有保護(hù)作用。揭示sRAGE在內(nèi)毒素致傷后的肺內(nèi)表達(dá)，論證其對(duì)急性肺損傷的作用及機(jī)制有助于對(duì)RAGE通路的理解并為以RAGE為靶點(diǎn)的治療方向奠定理論基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外關(guān)于RAGE的研究以慢性炎癥性疾病為主，已取得重大進(jìn)展，但急性炎癥相關(guān)報(bào)道罕見，關(guān)于急性肺損傷與RAGE的干預(yù)研

6、究更是空白。為明確RAGE及其變異體在內(nèi)毒素肺損傷發(fā)病中的作用，我們建立小鼠LPS肺損傷模型，觀察LPS氣管內(nèi)滴注后肺內(nèi)RAGE及其變異體在蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化；通過sRAGE干預(yù)驗(yàn)證其是否對(duì)LPS介導(dǎo)的肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用；并從炎癥與凋亡兩方面評(píng)價(jià)sRAGE肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制，從而為感染相關(guān)性肺損傷的防治開辟新的前景。 方法: (1)小鼠脂多糖肺損傷模型的建立C57BL/6J小鼠，8-11周齡，體重18-22g，

7、腹腔注射鹽酸氯胺酮(100mg/kg體重)和賽拉嗪(10mg/kg體重)麻醉后，經(jīng)頸正中切口游離氣管，以24G套管針行氣管穿刺，將套管插入左主支氣管，向左肺內(nèi)注入3mg/kg體重的E．coli LPS(濃度為1.2mg LPS/ml PBS)，對(duì)照組(PBS組)用相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate-buffered saline，PBS)代替LPS氣管內(nèi)注入。 (2)LPS氣管內(nèi)注入后不同時(shí)點(diǎn)采集肺組織標(biāo)本，于24h收

8、集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)，用蛋白印記(Western blot)方法分析各時(shí)點(diǎn)肺組織勻漿及LPS滴入后24h BALF中RAGE及其變異體蛋白的表達(dá)；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)檢測各時(shí)點(diǎn)肺組織中RAGE mRNA和esRAGE mRNA的表達(dá)。 (3)LPS氣管內(nèi)注入后1h，sRAGE組小鼠接受100

9、ug sRAGE(溶于100ul PBS中)腹腔注射，LPS組在相同時(shí)點(diǎn)接受100ul PBS腹腔注射，PBS組于氣管內(nèi)滴注PBS后1h給與100ul PBS腹腔注射。三組動(dòng)物于氣管滴注后24h經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(250mg/kg體重)處死，采集BALF及肺組織，比較氣管滴注24h后組間BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)，白細(xì)胞介素-1β(Interleukin，IL-1β)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Fa

10、ctor-α，TNF-α)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(Macrophage InflammatoryProtein，MIP-1α)、MIP-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)、角質(zhì)細(xì)胞起源趨化因子(Keratinoeyte-derived Chemokine，KC)8種細(xì)胞因子水平(Bio-Plex技術(shù))及肺組織病理學(xué)(H．E．染色)表現(xiàn)。 (4)為探討sRA

11、GE對(duì)脂多糖引起的肺內(nèi)NF-кB活化的影響，快速采集上述三組動(dòng)物L(fēng)PS注入后4h的肺組織，分離核提取物，應(yīng)用BD<'TM> TransFactor Chemiluninescent試劑盒分析核提取物中NF-кB P65 DNA結(jié)合活性作為評(píng)價(jià)NF-кB活化的指標(biāo)。應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling

12、，TUNEL)及激光共聚焦顯微鏡對(duì)上述三組動(dòng)物L(fēng)PS注入后24h肺組織石蠟切片行細(xì)胞凋亡原位檢測，比較各組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量。 (5)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析和學(xué)生t檢驗(yàn)，各組間差異用最小顯著差法進(jìn)行Post Hoc檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、RAGE及其變異體在LPS肺損傷小鼠肺內(nèi)的表達(dá)應(yīng)用抗RAGE細(xì)胞外區(qū)域的特異性抗體行W

13、estern blot檢測，發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白在未經(jīng)處置的0h組小鼠肺組織勻漿中呈現(xiàn)三條條帶，分子量分別約為54kD，48kD和38kD。LPS注入后6、12和24h，三條條帶強(qiáng)度均無明顯變化。相比之下，BALF中只檢測到分子量約48kD的單一條帶，氣管內(nèi)滴注PBS后24h，該條帶表達(dá)較弱，滴注LPS后24h，該條帶密度顯著增強(qiáng)(P<0.05)。 實(shí)時(shí)定量PCR檢測表明，LPS氣管內(nèi)滴注后6h，肺內(nèi)RAGE mRNA表達(dá)顯著下降，

14、此后6h、12h、24h呈逐漸下降趨勢，各時(shí)點(diǎn)與Oh(未處置小鼠)相比均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。相比之下，LPS注入后各時(shí)點(diǎn)esRAGE mRNA無顯著變化(P>0.05)。 2、sRAGE干預(yù)對(duì)LPS介導(dǎo)的急性肺損傷的影響與PBS組相比，滴注LPS后24h小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)均明顯增多(P<0.01)；LPS后1h腹腔注射sRAGE的小鼠比腹腔注射PBS的小鼠24h BALF中自細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)

15、胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)。與PBS組相比，小鼠氣管內(nèi)滴注LPS 24h后BALF中8種細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1 and KC)濃度均顯著增高(P<0.01)；LPS滴注后1h腹腔注射sRAGE的小鼠比腹腔注射PBS的小鼠24h BALF中TNF-α、MIP-1α和MIP-1β水平明顯降低(P<0.05)，但兩組間其他5種細(xì)胞因子水平未見顯著性差異(P>0.05)

16、。 光鏡下觀察H．E染色肺組織切片發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)滴注后24h，PBS組肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯中性粒細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫。LPS組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集，伴有明顯肺泡壁增厚、肺泡毛細(xì)血管充血滲出，部分肺泡萎陷。sRAGE組肺內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤較LPS組明顯減輕，肺泡壁充血水腫也明顯緩解。 3、sRAGE對(duì)LPS介導(dǎo)的肺內(nèi)NF-кB活化和細(xì)胞凋亡的影響LPS氣管內(nèi)滴注后4h，肺內(nèi)NF-кB p65 DNA結(jié)合活性

17、較PBS組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，LPS后1h sRAGE腹腔注射顯著抑制了LPS引起的NF-кB活化(P<0.05)。競爭分析證實(shí)了NF-кB與DNA的特異性結(jié)合。 TUNEL檢測顯示，氣管內(nèi)滴注后24h，PBS組僅有個(gè)別肺泡上皮細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光的陽性染色，LPS組陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多(與PBS組比較P<0.01)，sRAGE組陽性細(xì)胞數(shù)比LPS組明顯減少(P<0.05)。 結(jié)論: (1)RAGE及其變異體在

18、正常肺組織中表達(dá)豐富，脂多糖刺激引起其可溶性變異體向肺泡腔內(nèi)釋放增多。由全長RAGE蛋白水解導(dǎo)致C-末端截?cái)嘈纬蓅RAGE是脂多糖介導(dǎo)的肺泡腔中可溶性RAGE變異體的可能來源。 (2)應(yīng)用sRAGE阻止RAGE信號(hào)可抑制脂多糖引起的小鼠肺內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集、致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和肺組織病理改變，對(duì)脂多糖介導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用。 (3)sRAGE抑制脂多糖引起的NF-кB活化和肺泡上皮凋亡，通過抗炎和抗凋亡雙重機(jī)制對(duì)脂多糖