基于TRX轉(zhuǎn)基因細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷作用中對NO水平的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的:一氧化氮(nitricoxide，NO)是近年來新發(fā)現(xiàn)的生物信使分子，在生物體內(nèi)各組織中都有分布，尤其是神經(jīng)組織中。1992年美國Science雜志將其評選為明星分子。NO是一種結(jié)構(gòu)簡單的小分子，狀態(tài)極不穩(wěn)定，常溫下為氣體，具有水溶性和脂溶性，并可快速透過生物膜，只有3-5秒的半衰期，由NO供體L-精氨酸在一氧化化氮合成酶(nitricoxidesynthase，NOS)的催化下生成。并在心、腦血管、神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面起到十分重

2、要的生物學(xué)作用。因此，受到人們的普遍重視。在一氧化氮合酶(NOS)的催化下，L-精氨酸(L-Arg)作為機(jī)體的必需氨基酸之一，可轉(zhuǎn)化為L-胍氨酸和NO，然而，由于近年來學(xué)術(shù)界在NO的細(xì)胞保護(hù)方面的研究存在爭議——它的存在具有“雙刃劍”的作用。由于NO既可以影響Trx的活性，其本身對凋亡的影響也是極其復(fù)雜的。因此我們可根據(jù)控制NO供體L-精氨酸的量來間接控制細(xì)胞內(nèi)NO的含量，從而建立細(xì)胞的NO毒性模型，進(jìn)而來探討NO在細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中所

3、扮演的角色及其與TRX的關(guān)系。
　　 硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)在眾所周知的許多抗氧化還原蛋白中，作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的成員，在抗氧化系統(tǒng)中起著重要的作用。硫氧還蛋白的蛋白質(zhì)分子較小(約12kDa)。在許多還原反應(yīng)中作為氫供體，能在一定程度上清除細(xì)胞因氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的氧自由基。現(xiàn)已證實(shí)TRX對于神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)理卻不甚明確。由于氧自由基損傷廣泛參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并可作為其發(fā)病基礎(chǔ)。因此本實(shí)驗(yàn)選用小

4、鼠神經(jīng)嵴母瘤細(xì)胞(Neuro-2A)作為研究對象。Neuro-2A細(xì)胞是一種具有正常神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征的神經(jīng)瘤細(xì)胞并保留了一系列正常神經(jīng)細(xì)胞的功能，對于神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究具有廣泛的代表作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討TRX對神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用以及與NO的關(guān)系及其在NO信號(hào)通路中的影響機(jī)制。從而進(jìn)一步補(bǔ)充TRX對神經(jīng)系統(tǒng)具體的保護(hù)作用的研究資料，為臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供一條新思路。
　　 方法:以Neur

5、o-2A細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，利用乏氧箱模擬人體缺氧的內(nèi)環(huán)境并在其培養(yǎng)液中加人L-Arg(濃度為1mmol/L)模擬人體內(nèi)NO產(chǎn)生途徑，建立Neuro-2A細(xì)胞的NO毒性模型。乏氧/復(fù)氧4h后，觀察轉(zhuǎn)染TRX基因的Neuro-2A細(xì)胞和正常細(xì)胞的形態(tài)、存活率、凋亡率以及丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力變化。
　　 結(jié)果:乏氧組細(xì)胞較未乏氧組細(xì)胞損傷嚴(yán)重，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞稀疏，貼壁性差，突

6、起回縮，胞體明顯皺縮變小變圓，而轉(zhuǎn)染乏氧組多數(shù)細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁狀態(tài)較好，少數(shù)細(xì)胞的胞體皺縮變圓。
　　 1.MTT法檢測細(xì)胞存活率:兩組細(xì)胞經(jīng)乏氧和添加L-Arg乏氧后，兩組細(xì)胞存活率呈逐漸降低趨勢;但在各處理組中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞比正常細(xì)胞存活率增高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD的測定:乏氧組細(xì)胞較正常組細(xì)胞MDA逐漸升高，SOD活性逐漸降低(P＜0.05)。L-Arg乏氧組較單純乏氧組細(xì)胞

7、MDA逐漸升高，SOD活性逐漸降低(P＜0.05)。各處理組中轉(zhuǎn)染TRX基因的Neuro-2A細(xì)胞較正常Neuro-2A細(xì)胞MDA含量降低，SOD活性升高(P＜0.05)。
　　 3.細(xì)胞凋亡率的測定:乏氧組細(xì)胞較正常組細(xì)胞細(xì)胞存活率逐漸減低，凋亡率逐漸升高(P＜0.05)。L-Arg乏氧組較單純乏氧組細(xì)胞細(xì)胞存活率逐漸減低，凋亡率逐漸升高(P＜0.05)。各處理組中轉(zhuǎn)染TRX基因的Neuro-2A細(xì)胞較正常Neuro-2A細(xì)胞

8、凋亡率降低，存活率升高(P＜0.05)。
　　 4.細(xì)胞內(nèi)NO含量的測定:空白對照組與單純添加L-精氨酸組細(xì)胞中的NO含量比較無明顯差異。乏氧組細(xì)胞較正常組細(xì)胞NO含量逐漸升高(P＜0.05)。L-Arg乏氧組較單純乏氧組細(xì)胞NO含量逐漸升高(P＜0.05)。各處理組中轉(zhuǎn)染TRX基因的Neuro-2A細(xì)胞較正常Neuro-2A細(xì)胞NO含量降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:一、TRX基因表達(dá)的硫氧還蛋白具有抗氧化損傷的作