MicroRNA-29b在日本血吸蟲鼠肝纖維化中表達(dá)及機(jī)制的初探.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)部分展開論述：
　　第一章 MicroRNA-29b在日本血吸蟲小鼠肝纖維化組織中的表達(dá)變化
　　目的：
　　MicroRNA-29（miR-29）家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類與纖維化疾病密切相關(guān)的小分子RNA，其家族成員包括miR-29a、miR-29b、miR-29c。研究發(fā)現(xiàn)miR-29可通過直接抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)和調(diào)控多種信號(hào)通路參與纖維化過程。但其在日本血吸蟲病肝纖維化中的作用尚未見報(bào)道，以

2、miR-29b為代表進(jìn)行研究。建立日本血吸蟲肝纖維化小鼠模型，初步觀察miR-29b在肝臟組織中的表達(dá)情況，旨在探討miR-29b在日本血吸蟲肝纖維化中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　Balb/cJ小鼠隨機(jī)分為感染組和未感染組(n=15只)，經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴（15±2）條/只，建立日本血吸蟲肝纖維化模型，未感染組不做任何處理。分別于感染第6w、8w、10w處死小鼠，取其肝組織，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測4w、6w

3、、8w、10w、14w未感染組及感染組肝組織中miR-29 mRNA表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　在血吸蟲病肝纖維化組織中，實(shí)時(shí)定量RT-PCR顯示miR-29b的表達(dá)呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化，在感染6w時(shí)下調(diào)最為顯著，而在第8w、10w逐漸上升，14w趨于穩(wěn)定，但仍低于未感染組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而不同時(shí)間點(diǎn)未感染組間miR-29b表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　在未感染組及感

4、染組肝組織中，miR-29b表達(dá)存在顯著差異。在感染組肝組織中miR-29b明顯下調(diào)，提示與血吸蟲肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。研究其調(diào)控方式,可為進(jìn)一步探索血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機(jī)制提供研究依據(jù)。
　　第二章 MicroRNA-29b過表達(dá)在NIH/3T3細(xì)胞的靶向作用
　　目的：
　　miR-29b己被證明在日本血吸蟲病肝纖維化組織中表達(dá)下調(diào)。多項(xiàng)研究亦表明，用生物信息學(xué)方法預(yù)測出COL1α1及COL3α1的3′非編碼

5、區(qū)與miR-29有互補(bǔ)序列，本實(shí)驗(yàn)通過過表達(dá)miR-29b對(duì)COL1α1及COL3α1是否為miR-29b的直接靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。并將進(jìn)一步對(duì)miR-29b是否通過調(diào)控膠原蛋白在血吸蟲病肝纖維化中發(fā)揮作用進(jìn)行探討。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞，分為三組：miR-29b mimics組、miR-NC（miR-Negative Control）組及空白組。將miR-29b mimics及miR-NC與轉(zhuǎn)染試劑lipo

6、2000共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞48小時(shí)后，采用RT-PCR驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并檢測COL1α1及COL3α1mRNA表達(dá)水平；采用Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)COL1及COL3蛋白質(zhì)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　RT-PCR結(jié)果顯示，miR-29b mimics組與MiR-NC組和空白組比較，miR-29b表達(dá)上調(diào),同時(shí)COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)<

7、br>　　結(jié)論：
　　證實(shí)COL1α1及COL3α1是miR-29b的直接靶向調(diào)控分子，miR-29b通過抑制COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白表達(dá)在纖維化疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。
　　第三章 過表達(dá)MiR-29b影響TGF-β1致NIH/3T3細(xì)胞功能變化
　　目的：
　　COL1α1及COL3α1是miR-29b的直接靶向調(diào)控分子，miR-29b通過抑制COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白的表達(dá),在纖

8、維化疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。TGF-β1是目前已知的最重要的致肝纖維化細(xì)胞因子。既可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，又可抑制其降解，在HSC激活過程中起重要作用。進(jìn)一步研究miR-29b能否抑制TGF-β1所致NIH/3T3細(xì)胞功能變化如細(xì)胞增殖活力與凋亡及纖維化指標(biāo)，對(duì)于探討血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，分為TGF-β1+miR-29b mimics組、TGF-β1+MiR-NC組、TGF-β

9、1組和空白對(duì)照組。TGF-β1+miR-29b mimics組和TGF-β1+MiR-NC組為細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染miR-29b mimics或MiR-NC100nm4～6h后，再加入10ng/ml TGF-β1，TGF-β1組為僅加入10ng/ml TGF-β1，空白對(duì)照組不做任何處理，于48h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR及Western Blot檢測細(xì)胞中各纖維化指標(biāo)mRNA及蛋白水平變化情況，同時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況，CCK-

10、8檢測細(xì)胞活力變化。
　　結(jié)果：
　　1.常規(guī)培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞可表達(dá)miR-29b，不同濃度TGF-β1（0、1、2.5、5、10ng/ml）干預(yù)24h后miR-29b呈逐漸下降趨勢，10ng/ml TGF-β1干預(yù)NIH/3T3細(xì)胞24h時(shí)miR-29b表達(dá)最低。然后以10ng/ml TGF-β1在不同時(shí)間（6h、12h、24h、48h、72h）干預(yù)NIH/3T3細(xì)胞，miR-29b亦呈逐漸下降的趨勢，以72h表達(dá)最

11、低。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-29b mimics100nm48h，miR-29b表達(dá)明顯上調(diào)，與其他三組比較有顯著性差異。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-29b mimics48h后，NIH/3T3細(xì)胞膠原合成和分泌明顯減少，其他纖維化指標(biāo)如TIMP-1、HSP47、α-SMA mRNA及蛋白均明顯下降，MMP-9 mRNA及蛋白均明顯升高，與NC組及TGF-β1組及空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.轉(zhuǎn)染48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測

12、結(jié)果顯示miR-29b mimics組早期凋亡明顯增多，而TGF-β1組及TGF-β1+NC組細(xì)胞凋亡下調(diào)，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.轉(zhuǎn)染48h后，miR-29b mimics組細(xì)胞活力明顯下降，而 TGF-β1組及TGF-β1+MiR-NC組細(xì)胞活力明顯上調(diào)，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　初步證實(shí)miR-29b mimics體外上調(diào)miR-29b表達(dá)有效；miR-29b表達(dá)上調(diào)可抑制TGF-β