Rho GTPases及效應(yīng)子IQGAP1在氣道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、氣道上皮細(xì)胞中機(jī)械劃傷致IQGAP1磷酸化對損傷修復(fù)的影響 由于氣道（氣管和支氣管）粘膜暴露于外界環(huán)境，易受到損傷。氣道上皮受損后將立即啟動修復(fù)過程，從而保持正常的肺功能。這個(gè)損傷修復(fù)過程需要?dú)獾郎掀ぜ?xì)胞伸展，遷移和增生最終覆蓋受損區(qū)域。氣道受損是氣道疾病例如慢性支氣管炎和COPD的重要的發(fā)病過程。因此氣道上皮自身的修復(fù)能力是解決這些氣道疾病的關(guān)鍵步驟。然而，參與氣道上皮損傷修復(fù)的分子機(jī)制尚

2、未完全明了。 IQGAP1（IQ domain GTPase-activating protein）在許多細(xì)胞生命活動中是一個(gè)非常有意義的蛋白，但是尚未有人闡述其在氣道上皮損傷修復(fù)中的作用。磷酸化作為翻譯后的主要手段，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)及細(xì)胞骨架的功能。有報(bào)導(dǎo)顯示，IQGAP1絲氨酸殘基能被高磷酸化，結(jié)果能促進(jìn)神經(jīng)元軸突外生性生長。PKC的一個(gè)新的亞型PKCε可能有助于IQGAP1的磷酸化。我們推測，在氣道上皮損傷修復(fù)過程中IQGA

3、P1磷酸化可能發(fā)揮重要作用。 目的： 使用目前廣泛應(yīng)用的刮傷氣道上皮細(xì)胞的體外模型，初步探討機(jī)械劃傷后IQGAP1的磷酸化水平以及對損傷修復(fù)的影響。 方法： 建立機(jī)械劃痕引起體外氣道上皮損傷模型，采用損傷分析實(shí)驗(yàn)、免疫組化、western blot、免疫熒光共聚焦成像、免疫沉淀、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等方法觀測IQGAP1磷酸化、IQGAP1與PKCε在損傷前后的變化，并通過激活和抑制PKCε活性，觀察對損傷愈合的影響

4、。 結(jié)果： 形態(tài)學(xué)觀察顯示培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞典型的鋪路石狀形態(tài)，其特點(diǎn)是立體的，稍微凸起的，細(xì)胞間緊密連接。在機(jī)械性損傷后，氣道上皮細(xì)胞可成片狀的單向遷移，且其遷移方向垂直于劃痕方向。損傷6 h細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生顯著改變，形成具有特征性的極化形態(tài)學(xué)改變，損傷12 h更為顯著。損傷24 h后遷移的氣道上皮細(xì)胞能掩蓋劃線部分。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IQGAP1在多種動物氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富。它與微管骨架共定位，但能

5、被微管解聚劑nocodazole破壞。機(jī)械劃傷后，IQGAP1磷酸化水平迅速增加，在損傷后1小時(shí)達(dá)到峰值，持續(xù)9小時(shí)。過表達(dá)PKCε或添加PKC活化劑PMA，能促進(jìn)IQGAP1磷酸化。相反，PKC抑制劑GF109203X能消除劃傷引起的IQGAP1磷酸化。通過免疫熒光共聚焦和免疫共沉淀方法，我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械劃傷能加強(qiáng)IQGAP1與PKCε結(jié)合。損傷分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刮擦24h后，正常對照組細(xì)胞劃痕已經(jīng)閉合，而過表達(dá)PKCε或PMA處理組細(xì)胞

6、劃痕提前愈合。相反，GF109203X處理組不僅沒有閉合，而且其劃痕寬度仍占原始劃痕的32％，提示IQGAP1磷酸化介導(dǎo)了氣道上皮細(xì)胞的劃痕愈合。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)表明，IQGAP1在氣道上皮細(xì)胞中有豐富的表達(dá)，且PKCε介導(dǎo)的IQGAP1磷酸化參與了機(jī)械劃傷引起的氣道上皮細(xì)胞損傷愈合過程。 第二部分、IQGAP1以不依賴于Rac1和Cdc42的方式參與氣道上皮損傷修復(fù)的增殖過程 香煙煙霧、大氣污染、感染等

7、多種致病因素在機(jī)體抵抗力降低時(shí)，都能引起氣道上皮損傷，導(dǎo)致肺疾病的發(fā)生。氣道損傷后立即啟動修復(fù)過程，這是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，包括細(xì)胞延伸、遷移和增殖。Rho GTPases是小G蛋白超家族的主要成員，其中RhoA，Rac1和Cdc42研究最為廣泛。Rho GTPases在GTP結(jié)合的活化狀態(tài)和GDP結(jié)合的失活狀態(tài)間轉(zhuǎn)換。通過與許多效應(yīng)子的作用，如IQGAP1、PAK（p21 activated kinase）和WASP（Wiskott

8、-Aldrich syndrome protein），Rho GTPases在組織形成、細(xì)胞極化和遷移過程中發(fā)揮重要作用。作為Rac1和Cdc42的效應(yīng)子，IQGAP1能與細(xì)胞骨架成分、細(xì)胞黏附復(fù)合體及微管相關(guān)蛋白結(jié)合，參與了細(xì)胞黏附、極化和定向遷移過程。目前尚未有人闡述Rho GTPases及IQGAP1在肺上皮細(xì)胞中的作用。本研究推斷上述信號可能在氣道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)中發(fā)揮作用，并探討其可能的機(jī)制。 目的： 使用了體

9、外損傷模型來研究Rho GTPases及IQGAP1的功能。檢測上述因子在氣道上皮不同損傷修復(fù)時(shí)期的動態(tài)表達(dá)變化，初步研究其在氣道上皮損傷修復(fù)過程中的作用，繼而為深入探討損傷修復(fù)機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 在機(jī)械劃傷單層細(xì)胞建立的體外損傷模型中，通過pull-down方法檢測Rac1及Cdc42的活性。采用免疫細(xì)胞熒光、RT-PCR、熒光定量PCR、western blot、分離核漿蛋白、質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和RNA干擾方

10、法觀測IQGAP1及相關(guān)因子在氣道上皮損傷模型中的表達(dá)和分布變化，并探討上述信號影響損傷修復(fù)的可能機(jī)制。 結(jié)果： 機(jī)械劃傷能降低GTP結(jié)合的Rac1和Cdc42，但能促進(jìn)IQGAP1 mRNA及蛋白表達(dá)。我們證實(shí)IQGAP1能結(jié)合組成性激活型Rac1（Rac1V12）和Cdc42（Cdc42V12），但不能結(jié)合顯性負(fù)突變型Rac1（Rac1N17）和Cdc42（Cdc42N17）。在實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用了IQGAP1的突變體T1

11、050AX2，該突變體在1050－1052位氨基酸均被丙氨酸替代，缺乏與Rho GTPases結(jié)合的能力。研究發(fā)現(xiàn)，劃傷和過表達(dá)外源性IQGAP1（wild type和T1050AX2）都能使β-catenin核轉(zhuǎn)位從而活化Tcf/Lef信號。同時(shí)，過表達(dá)上述外源性IQGAP1也能促進(jìn)Tcf 靶基因c-myc和cyclinD1表達(dá)。此外，刮傷可影響IQGAP1與β-catenin、adenmatous polyposis coli（AP

12、C）及cytoplasmic linker protein- 170（CLIP-170）之間的相互作用。通過小干擾RNA（siRNA）消除IQGAP1的表達(dá)可明顯延遲損傷愈合。我們總結(jié)認(rèn)為，IQGAP1信號參與了氣道上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)，且以不依賴于Rac1和Cdc42的方式介導(dǎo)了細(xì)胞增殖過程。 結(jié)論： 上述結(jié)果表明：（1）IQGAP1可能通過表達(dá)量上調(diào)參與氣道上皮受損后啟動的修復(fù)。（2）IQGAP1以不依賴于Rac1和C

13、dc42的方式促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位，活化Tcf信號并誘導(dǎo)其靶基因c-myc和cyclin-D1表達(dá)。（3）劃傷能減弱β-catenin與α-catenin的結(jié)合，但加強(qiáng)β-catenin與IQGAP1的結(jié)合。（4）機(jī)械損傷能增強(qiáng)IQGAP1與微管相關(guān)蛋白APC、CLIP-170之間的作用。（5）敲低IQGAP1能明顯阻滯劃痕愈合。 本實(shí)驗(yàn)提示：IQGAP1可通過表達(dá)上調(diào)而活化β-catenin/Tcf信號途徑，參與機(jī)械刮