Integrinβ4在氣道上皮細胞應激反應功能穩(wěn)態(tài)中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：氣道上皮細胞是呼吸系統(tǒng)與外界接觸的第一道天然屏障，越來越多的研究表明氣道上皮細胞可以通過自身的機械性屏障功能、分泌功能、代謝功能與抗原呈遞功能等過程參與對呼吸系統(tǒng)的應激反應及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。因此，氣道上皮的結構與功能穩(wěn)態(tài)是呼吸系統(tǒng)維持正常換氣功能和防御功能的細胞基礎。氣道上皮細胞是一層排列緊密的假復層上皮細胞，通過細胞與細胞之間以及細胞與基底膜之間的粘附氣道上皮細胞整齊排列并粘附在基底膜上。氣道上皮的結構性整合粘附依賴于氣道上皮

2、表達的粘附分子家族。Integrinβ4是氣道上皮細胞表達的一類結構性粘附分子蛋白，通過半橋粒結構介導氣道上皮細胞與基底膜的粘附及整合。與整合素其它家族成員不同，integrinβ4胞內含有一段特殊的結構性功能域，提示其可能參與氣道上皮細胞的一系列信號通路，進而與氣道上皮的應激反應、功能穩(wěn)態(tài)密切相關。但是，除了粘附功能以外，integrinβ4在氣道上皮的表達及功能屬性的相關研究很少。本實驗室在先前的研究中應用基因芯片及生物信息學方法篩

3、選了哮喘病人外周血白細胞差異表達的粘附分子，發(fā)現integrinβ4基因在哮喘病人中表達明顯下調，提示integrinβ4表達改變可能與哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關，但具體的內在機制仍不清楚。因此，本課題研究主要包括以下幾個部分：
　　 (1)Integrinβ4在氣道上皮細胞氧化應激、損傷修復中的作用；
　　 (2)Integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達及與哮喘發(fā)病的相關性；
　　 (3)Integr

4、inβ4與臭氧應激后AHR發(fā)病的相關性；
　　 (4)Integrinβ4對氣道上皮細胞抗原呈遞及淋巴細胞分化的調節(jié)。
　　 方法與結果：
　　 1)Integrinβ4在氣道上皮細胞氧化應激及損傷修復中的作用體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細胞株(16HBE14o-)及原代大鼠氣道上皮細胞(RTE)，分別用臭氧攻擊30 min，免疫組化及流式檢測顯示，臭氧應激后，integrin p4在16HBE140-及RTE細胞上的

5、表達明顯上調。建立OVA應激的大鼠哮喘模型，抗氧化能力檢測顯示活性氧自由基在OVA應激后的大鼠氣道上皮細胞中含量明顯增加，免疫組化及realtime RT-PCR.結果顯示integrinβ4在OVA模型大鼠的氣道上皮表達下調，以上結果提示integrinβ4可能參與了氣道上皮細胞的氧化應激過程。
　　 另外，我們觀察了integrinβ4在機械損傷后的氣道上皮細胞的表達，在生長融合的16HBE14o-及RTE細胞培養(yǎng)板上機械刮

6、擦形成一個損傷區(qū)域，12h后免疫細胞化學觀察發(fā)現在機械損傷邊緣的氣道上皮細胞呈現遷移趨勢，integrinβ4在損傷邊緣的上皮細胞表達顯著上調，提示integrinβ4可能參與了氣道上皮的損傷修復過程。
　　 為闡明integrinβ4在氣道上皮細胞損傷修復及氧化應激過程中的作用，我們利用integrinβ4高表達載體和integrinβ4沉默載體建立integrinβ4在RTE細胞中的高表達和沉默細胞系，籍此觀察integri

7、nβ4在氣道上皮細胞氧化應激及損傷修復中的作用。損傷修復能力用損傷修復指數測定，增殖由MTT法測定。抗氧化能力及三種抗氧化酶的表達通過相應的試劑盒檢測。結果顯示integrinβ4表達上調可明顯促進RTE的損傷修復能力，其調節(jié)能力可能與上皮細胞的增殖能力相關。另外，integrinβ4的表達水平與RTE的抗氧化能力密切相關，其表達上調可增進RTE的總抗氧化能力，進一步結果提示integrinβ4對RTE抗氧化能力的調節(jié)與GSH-Px，S

8、OD，catalase三種抗氧化酶的表達水平相關。
　　 以上結果提示integrinβ4作為經典的結構性粘附分子在氣道上皮細胞組成性表達，其表達受各種刺激因素敏感調節(jié)。除結構性粘附功能外，integrinβ4還參與到對氣道上皮細胞的損傷修復、抗氧化能力等過程的調節(jié)。在OVA應激后的哮喘模型中，氣道上皮細胞integrinβ4表達明顯下調，進而誘導氣道上皮細胞損傷修復過程減慢，抗氧化能力降低，與OVA應激后的哮喘表型緊密相關。因

9、此，我們推斷integrinβ4可能與哮喘、變應性鼻炎等氣道上皮性疾病的發(fā)病相關。
　　 2)Integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達及其與哮喘發(fā)病的相關性本實驗室在先前的研究中應用基因芯片及生物信息學方法篩選了哮喘病人外周血差異表達的粘附分子，結果發(fā)現integrinβ4基因在所有哮喘病人中表達均下調。Integrinβ4是一類經典的結構性粘附分子，它在氣道上皮細胞組成性表達維持氣道上皮的結構及功能完整。哮喘病人氣道上皮表

10、現為明顯的結構損傷及上皮脫落，提示可能存在粘附分子成員的表達缺陷。因此我們推測integrinβ4在哮喘病人的氣道黏膜可能存在差異表達并與哮喘發(fā)病相關。為探討integrinβ4在支氣管肺組織的分布表達及其與哮喘發(fā)病的相關性，這一部分工作我們觀察了integrinβ4在正常人及哮喘病人的氣道粘膜的表達。
　　 免疫組化結果顯示，在正常人的氣道黏膜，上皮結構完整，上皮細胞排列整齊，integrinβ4組成性高表達。在哮喘病人的氣道

11、黏膜，上皮細胞出現結構損傷，上皮細胞松動脫落明顯，integrinβ4的膜內及膜外蛋白表達明顯下調。為進一步研究哮喘病人氣道黏膜integrinβ4表達下調與哮喘發(fā)病的相關性。我們設計并篩選integrinβ4特異性siRNA(small interference)序列，進一步構建包裝為慢病毒載體，在16HBE14o-沉默integrinβ4基因后，觀察16HBE14o-在integrinβ4表達下調后粘附能力、損傷修復過程、細胞周期及

12、細胞凋亡的變化。結果顯示integrinβ4沉默后，16HBE14o-粘附率明顯減低，細胞增殖周期被抑制，大量細胞停留在G1期，S期細胞明顯減少，G2/G1減小，損傷修復速度減慢，細胞凋亡明顯增加。
　　 以上結果提示integrinβ4在哮喘病人氣道上皮細胞表達明顯下調，進而誘發(fā)了氣道上皮細胞的粘附率降低，G1期阻止，損傷修復速度減慢，細胞活力降低，凋亡率增加，與哮喘病人氣道上皮細胞病理改變的臨床表型及發(fā)病機制密切相關。

13、>　　 3)Integrinβ4與臭氧應激誘導的AHR(airway hyperresponsiveness，氣道)發(fā)病的相關性AHR是哮喘，變應性鼻炎等呼吸系統(tǒng)疾病的主要臨床表現之一。大量的動物實驗及離體實驗研究發(fā)現AHR的發(fā)病與氣道上皮細胞的結構完整及功能穩(wěn)態(tài)相關。本研究第二部分結果顯示，integrinβ4在哮喘病人的氣道黏膜表達特異性下調，誘導氣道上皮的增殖抑制，損傷修復減慢，與哮喘病人氣道上皮細胞的病理改變密切相關。我們推測

14、integrinβ4缺陷表達誘導的上皮細胞功能失穩(wěn)態(tài)可能與AHR的誘發(fā)有關。
　　 為研究integrinβ4表達與AHR之間可能存在的內在聯(lián)系，我們建立了臭氧攻擊不同時間誘導的AHR動物模型。在臭氧攻擊不同時間點，分別檢測臭氧攻擊誘導的的氣道反應性和integrinβ4的表達水平。RL(lung resisitence)由Buxco小動物呼吸功能測量系統(tǒng)檢測，結果提示，臭氧攻擊后可誘發(fā)明顯的AHR，AHR程度伴隨臭氧攻擊時間的

15、增長而更加明顯。臭氧攻擊結束后，AHR改變逐漸減弱回復正常。免疫組化及real time RT-PCR定量檢測integrinβ4表達水平，結果顯示臭氧攻擊后，integrinβ4蛋白及mRNA表達水平伴隨臭氧攻擊而逐漸下調，臭氧攻擊結束后，integrinβ4表達逐漸上升恢復。相關性分析結果顯示臭氧攻擊AHR模型中，組胺激發(fā)后的RL水平與integrinβ4表達水平呈明顯負相關，提示臭氧攻擊后AHR的誘發(fā)可能與integrinβ4表達

16、密切相關。體外沉默integrinβ4在16HBE14o-的表達，結果發(fā)現integrinβ4下調后16HBE14o-抗細胞氧化能力減弱，細胞凋亡明顯增加。
　　 以上結果提示，臭氧攻擊大鼠后誘發(fā)明顯AHR病變。Integrinβ4在臭氧攻擊后的大鼠氣道上皮表達明顯下調，進而誘導氣道上皮細胞抗氧化能力減弱，細胞凋亡增加，可能與臭氧攻擊后AHR發(fā)病相關。
　　 4)Integrinβ4對氣道上皮細胞抗原呈遞及淋巴細胞分化的

17、調控氣道上皮在抗原應激后可識別抗原并進行抗原呈遞，進而誘導氣道局部的淋巴細胞增殖分化，故氣道上皮細胞的抗原呈遞過程與氣道局部的免疫炎癥反應緊密相關。哮喘病人氣道黏膜局部表現為典型的Th2型淋巴細胞炎癥反應，本研究第二部分結果顯示，integrinβ4在哮喘病人氣道上皮表達下調，且與哮喘病人氣道上皮細胞的結構功能失穩(wěn)態(tài)密切相關。我們推測哮喘病人氣道上皮細胞integrinβ4表達下調可能參與對氣道上皮細胞抗原呈遞過程的調節(jié)，進而與哮喘病人

18、氣道局部T淋巴細胞分化及Th2型炎癥表型相關。為驗證以上假設，本研究觀察了integrinβ4下調對氣道上皮細胞的抗原呈遞能力及T淋巴細胞的增殖及分化的影響。
　　 免疫熒光實時定量觀察結果顯示integrinβ4沉默后氣道上皮細胞對外界抗原的識別及攝取能力明顯減慢；對照上皮細胞和integrinβ4沉默上皮細胞分別與T淋巴細胞共培養(yǎng)，用CFSE-DA標記T淋巴細胞檢測淋巴細胞增殖，ELISA(enzyme linked imm

19、unosorbent assay)檢測共培養(yǎng)后細胞上清液中的細胞因子含量。結果顯示：與正常上皮細胞+淋巴細胞共培養(yǎng)體系相比，與integrinβ4沉默氣道上皮細胞+T淋巴細胞共培養(yǎng)體系中T淋巴細胞活化增殖能力降低，共培養(yǎng)體系上清液中Th1型細胞因子IFN-gamma減少，Th1/Th2比值降低。
　　 以上結果提示integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達下調誘導氣道上皮細胞抗原呈遞能力減弱，并抑制氣道黏膜局部T淋巴細胞Th1

20、性增殖分化，與哮喘病人氣道黏膜局部的Th2型炎癥反應密切相關。
　　 結論：
　　 Integrinβ4在氣道上皮細胞組成性表達，其表達受各種外界刺激敏感調節(jié)。除結構性粘附功能外，integrinβ4參與對氣道上皮細胞損傷修復、抗氧化等生理功能穩(wěn)態(tài)的維持與調節(jié)。Integrinβ4在哮喘病人氣道上皮及哮喘模型動物氣道上皮表達下調，導致上皮結構性損傷及功能失穩(wěn)態(tài)，誘導AHR，調控氣道局部的淋巴細胞向 Th2型炎癥反應增殖分