IQGAP1在高糖誘導(dǎo)足細胞凋亡中的作用及其機制探討.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病是臨床上一種常見內(nèi)分泌性疾病，它是由于多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所致。持續(xù)高血糖與長期代謝紊亂等可導(dǎo)致全身組織器官的多種并發(fā)癥，尤其是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的慢性進行性病變、功能減退或衰竭。糖尿病的全身血管并發(fā)癥分為大血管并發(fā)癥和微血管并發(fā)癥，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其臨床表現(xiàn)主要為高血

2、壓、水腫、嚴(yán)重蚩白尿、低白蛋白血癥和進行性腎功能減退;腎臟病理主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀或彌漫性系膜細胞增殖、基底膜(GBM)增厚，系膜細胞外基質(zhì)積聚、足細胞足突融合，腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。糖尿病腎病是目前世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的首位位病因，增加各國衛(wèi)生保健事業(yè)支出的同時也給予社會、家庭、個人帶來沉重負擔(dān)。在我國糖尿病腎病發(fā)病率以及在終末期腎衰竭透析患者中所占的比例也成逐年增加趨

3、勢，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。因此，探討糖尿病腎病的發(fā)病機制、及早發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病并給予適當(dāng)干預(yù)治療措施對廣大糖尿病腎病患者具有重要的社會和現(xiàn)實意義。DN的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及到糖脂代謝紊亂、炎癥介質(zhì)釋放、血流動力學(xué)異常、細胞因子、氧化應(yīng)激以及細胞凋亡等多因素的作用。近年來的研究顯示，腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變，尤其是作為腎小球濾過屏障重要組成成分的足細胞損傷，在糖尿病腎病的進展中發(fā)揮了舉足輕重的作用，被認(rèn)為是引起DN蛋白尿和腎小球

4、硬化的關(guān)鍵因素。因此，研究足細胞的損傷為DN的預(yù)防和治療帶來了新的契機。
　　足細胞又稱為臟層腎小球上皮細胞，附著于腎小球基底膜外側(cè)，與腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)、內(nèi)皮細胞共同構(gòu)成腎小球濾過屏障。足細胞的主要作用是對蛋白質(zhì)的濾過及GBM成分的更新起著舉足輕重的作用。由于足細胞是高度分化細胞，增殖能力較差，當(dāng)足細胞受到損傷時，尿蛋白漏出增加，從而加重腎衰竭的發(fā)生，而蛋白尿又進一步

5、加重足細胞的損傷。
　　在DN的發(fā)生發(fā)展中，足細胞的改變主要包括足細胞數(shù)目減少，細胞凋亡增加，流動性增強，直至足細胞從GBM上脫落隨尿液排出，導(dǎo)致GBM裸露，形成局灶粘連和腎小球硬化。DN足細胞損傷機制復(fù)雜，其不是單由某個因素所誘發(fā)，而是多個因素的聯(lián)合作用。主要包括腎蛋白(nephrin)、高血糖、整合素、機械應(yīng)力、炎性反應(yīng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活、AGEs的蓄積、GH-胰島素樣生長因子(insulin-l

6、ike growth factor，IGF)-Ⅰ軸、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、類肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)、腫瘤抑制基因(wT1)、Podocalyxin蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體(perox-isome proliferatoractivatedreceptor，PPAR)、脂聯(lián)素、微小RNA(micro RNA，miRNA)、TGF-β1、氧化應(yīng)激及細胞凋亡等。
　　有研究顯示，IQ結(jié)構(gòu)域GTP酶活化蛋白Ⅰ(IQ

7、domain GTPase-activatingprotein1，IQGAP1)是一種含有多個蛋白結(jié)合域的支架蛋白，近期研究發(fā)現(xiàn)IQGAP1在細胞黏附遷移、維持細胞形態(tài)以及調(diào)節(jié)細胞凋亡等眾多生命過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用[1，2]。
　　IQGAP1是否參與高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡尚未見報道，基于上述理論基礎(chǔ)，我們設(shè)計并進行了本次研究。本課題分為兩部分，第一步部分，采用體外培養(yǎng)人腎臟足細胞(HPC)，觀察高糖刺激對IQGAP1表達和分

8、布以及對足細胞凋亡的影響。第二部分，進一步觀察IQGAP1與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路以及腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在足細胞凋亡中的作用，探討高糖誘導(dǎo)腎臟足細胞凋亡的分子機制，從而為更好的治療糖尿病腎病提供理論支持。
　　第一部分高糖刺激對足細胞中IQGAP1表達和分布以及凋亡的影響
　　研究目的:
　　1、觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下 IQGAP1表達情況;
　　2、觀察人腎臟足細胞

9、在體外高糖刺激下 IQGAP1分布情況;
　　3、觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下細胞凋亡情況。
　　研究方法:
　　HPC在33℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中，以含有10％胎牛血清及γ-干擾素(10 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞使其增殖，傳代后更換為不含γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)液，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，促進細胞分化成熟，用于后續(xù)實驗。HPC被隨機分為3組:A組:正常對照組(N

10、ormal Control，NC，)、B組:甘露醇對照組(Manitol+Glucose Control，MG)和C組:高糖組(HighGlucose，HG)。NC組細胞給予D-glucose5.5mmol/L，為了控制高滲透壓對細胞實驗結(jié)果可能帶來的影響，MG組給予D-glucose5.5mmol/L+24.5mol/L甘露醇作為對照，HG組給予D glucose30mmol/L。各組細胞同步培養(yǎng)0、12、24、48、72小時后分別收

11、集，應(yīng)用免疫熒光法觀察IQGAP1在各組環(huán)境足細胞中的表達及其分布情況，real-time PCR法檢測IQGAP1mRNA在各組不同環(huán)境下足細胞中的表達情況。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、從Fig.1-1可以看出IQGAP1在足細胞的胞漿與細胞核中都有表達，但主要存在于細胞核內(nèi);
　　2、Fig.1-2、Fig.13A、3B、3C顯示，在0小時，正常對照組、甘露醇對照組和高糖組IQGAP

12、1的表達量無顯著性差異;在48小時，免疫熒光顯示:甘露醇組與正常糖組比較，IQGAP1的表達量變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在高糖刺激下，IQGAP1的表達水平明顯下調(diào)，IQGAP1的表達量與正常糖對照組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　3、Fig.1-4A、B、C、D顯示，流式細胞儀檢測足細胞凋亡，將位于右下象限的早期凋亡細胞和位于右上象限的晚期凋亡細胞之和記錄為凋亡細胞。0小時，正常糖組凋亡率1.73％±0.13％，甘露醇

13、組凋亡率2.1％±0.15％，高糖組凋亡率2.1％±0.12％，各組凋亡率無顯著性差異(P＞0.05);24小時，正常糖組凋亡率26.39％±4.57％，甘露醇組凋亡率30.44％±5.15％，高糖組凋亡率56.15％±6％;在48小時，正常糖組足細胞凋亡率37.76％±5.6％，甘露醇組凋亡率36.77％±4.27％，高糖組凋亡率68.9％±6.64％。與正常糖組比較，甘露醇組凋亡率無顯著性變化，高糖組凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

14、(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、在正常糖組、甘露醇組和高糖組三組的足細胞培養(yǎng)中，IQGAP1在胞漿與細胞核中均有表達，但主要存在于細胞核內(nèi);
　　2、高糖可以顯著下調(diào)IQGAP1的表達，且隨時間的延長下調(diào)表達進一步加劇;
　　3、高糖可以顯著提升足細胞的凋亡，且隨時間的延長凋亡率逐漸增加。
　　第二部分 IQGAP1在高糖誘導(dǎo)足細胞凋亡中的作用及其機制探討
　　研究目的:
　　1、通過流

15、式細胞儀檢測，觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下細胞凋亡情況以及探討與IQGAP1的關(guān)系;
　　2、通過RT-PCR、Western blotting觀察IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的表達情況，進一步探討IQGAP1與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中p-ERK1/2、ERK1/2的關(guān)系以及在足細胞凋亡中的作用;
　　3、觀察在高糖組足細胞培養(yǎng)巾加入貝那普利（10μmol/L）后IQGAP1、p-ERK1

16、/2、ERK1/2的蛋白表達情況以及細胞凋亡情況，進一步探討IQGAP1與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的作用關(guān)系，以及在足細胞凋亡中的作用;
　　4、觀察在高糖組足細胞培養(yǎng)中加入ERK1/2的特異性抑制劑u0126(10μmol/L)后IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白表達情況以及細胞凋亡情況，進一步探討IQGAP1在足細胞凋亡中的作用。
　　研究方法:
　　將上述在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天

17、后成熟HPC隨機分為5組(A-E組):A組:正常糖對照組(5.5mmol/L glucose，NC)、B組:甘露醇對照組（24.5mmol/L甘露醇+5.5mmol/L glucose，MG）、C組:高糖組(30mmol/L glucose，HG)、D組:貝那普利組(30 mmol/L glucose+10μmol/L benazepril)、E組:u0126抑制劑組（30 mmol/L glucose+10μmol/L u0126）。

18、各組細胞同步培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h時后收集，應(yīng)用免疫熒光法觀察IQGAP1在各組環(huán)境足細胞中的表達及其分布情況，real-time PCR、Western blotting檢測IQGAP1mRNA及蛋白在不同環(huán)境下足細胞中的表達情況。通過Western blot法檢測ERK1/2和P-ERK1/2的含量。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、HG抑制了IQGAP1的表達，增加P-ERK

19、1/2的表達，并且促進了HPC的凋亡;
　　2、貝那普利可以減輕高糖引起的IQGAP1抑制，上調(diào)IQGAP1的表達，下調(diào)P-ERK1/2水平。48小時，D組凋亡率50.54％±6.25％，比C組凋亡率68.9％±6.64％明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明貝那普利可以減輕引起高糖引起的HPC的凋亡;
　　3、U0126對高糖引起的IQGAP1的抑制沒有影響。48小時，E組凋亡率3.19％±1.68％，比C組凋亡率68.9％±6

20、.64％明顯下降，提示U0126可顯著減少HPC的凋亡率。
　　結(jié)論:
　　1、高糖通過下調(diào)IQGAP1的表達、增加p-ERK蛋白表達，促進HPC細胞的凋亡;
　　2、貝那普利可上調(diào)IQGAP1的表達，減輕高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡;
　　3、U0126抑制劑可減輕高糖引起的足細胞凋亡，但對高糖引起的IQGAP1的抑制沒有影響;
　　4、IQGAP1通過與ERK1/2 MAPK信號通路、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)