氧醚復(fù)合對膿毒癥的治療效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是外科重癥監(jiān)護(hù)病房（Intensive Care Unit，ICU）病人死亡的主要原因之一，由于高患病率、高死亡率、高治療費用的特點，使其成為人類健康的巨大威脅。因此，尋找針對膿毒癥的有效救治策略迫在眉睫！前期我們在離體和在體模型上均證實，0.5MAC（minimum alveolar concentration，最低肺泡有效濃度）異氟醚復(fù)合60％氧對膿毒癥具有保護(hù)效應(yīng)，抑制膿毒癥后的異常炎癥反應(yīng)，抑制脂多糖刺激后

2、NF-κB（Nuclear factor Kappa B，核因子-κB）核轉(zhuǎn)位，逆轉(zhuǎn)膿毒癥后部分microRNA（miRNA，微小RNA）的上調(diào)。
　　本研究擬在此基礎(chǔ)上，研究一氧化氮（nitric oxide，NO）在氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機制中的作用，驗證miRNA是否參與氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機制，研究氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)中對NF-κB信號通路的具體調(diào)控方式，研究Nrf2/HO-1（核因子相關(guān)因子-2/血紅素氧合酶1）抗炎

3、通路在氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機制中的作用，并探討氧醚復(fù)合對盲腸結(jié)扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）所致老齡鼠膿毒癥模型是否也有治療效應(yīng)。相信本研究的實施將為氧醚復(fù)合治療膿毒癥提供更多的實驗依據(jù)，也為研發(fā)新的膿毒癥治療策略提供新的可能靶點。
　　目的:
　　探討0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧對膿毒癥治療效應(yīng)機制，并在老齡鼠上驗證0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧及0.5MAC七氟醚復(fù)合60%氧

4、對膿毒癥的治療效應(yīng)。
　　材料與方法:
　　實驗1.將243只雄性昆明小鼠（25-30g）隨機分為7組：Sham+NS+Air組、CLP+NS+Air組、CLP+NS+100%Oxy組、CLP+NS+0.5MAC ISO+60%Oxy組、CLP+L-NAME+100%Oxy組、CLP+L-NAME+0.5MAC ISO+60%Oxy組和CLP+L-NAME+Air組。CLP+NS+Air、CLP+NS+100%Oxy、CLP

5、+NS+0.5MAC ISO+60%Oxy、CLP+L-NAME+100%Oxy、CLP+L-NAME+0.5MAC ISO+60%Oxy和CLP+L-NAME+Air組動物使用盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）法建立膿毒癥模型，Sham+NS+Air組動物只開腹，不實施盲腸結(jié)扎穿刺。治療組動物在CLP或Sham術(shù)后1h、6h分別給予0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧或單純100%氧吸入1h；非治療組直接吸入空氣。CLP或Sham前4h，給所有動物腹腔

6、注射20mg/kg L-NAME或等容積的生理鹽水。觀察動物7天存活情況。檢測指標(biāo)：血清炎癥因子水平；動脈血氣分析；腹腔灌洗液細(xì)菌計數(shù)。
　　實驗2.在我們以往研究中，0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧干預(yù)可顯著下調(diào)CLP后表達(dá)升高的4種miRNAs，即miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3074-2-3p、miR-542-3p。本研究中，首先構(gòu)建攜帶目的基因（miR-133a-3p、miR-141-3p、miR-3

7、074-2-3p、miR-542-3p）的慢病毒載體，然后用慢病毒感染 RAW264.7細(xì)胞或小鼠外周血白細(xì)胞，使之分別高表達(dá)這些miRNA。治療組細(xì)胞給予0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧治療；非治療組細(xì)胞正常培養(yǎng)。干預(yù)完成后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測炎癥因子水平。
　　實驗3.培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7），隨機分為6組：Veh組、Veh+0.5ISO+60%O組、Veh+100%O組、LPS組、LPS+0.5ISO+60%O組

8、和LPS+100%O組。LPS組使用脂多糖刺激細(xì)胞建立離體膿毒癥模型；Veh組給予正常培養(yǎng)基。治療組細(xì)胞在LPS刺激開始0.5小時后即開始給予0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧或單純100%氧治療；非治療組細(xì)胞正常培養(yǎng)。LPS刺激2小時后刮取細(xì)胞，提取總蛋白，利用Western blot法檢測p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)。
　　實驗4.培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，分組及處理同3。LPS刺激2小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液

9、檢測炎癥因子改變；收集細(xì)胞沉淀物，利用細(xì)胞免疫熒光法檢測Nrf2核定位情況，利用實時定量PCR和Western blot法檢測細(xì)胞Nrf2、HO-1 mRNA或蛋白的表達(dá)情況。
　　實驗5.將228只雄性老齡SD大鼠（12-14月齡）及120只青年SD大鼠（2-3月齡）隨機分為6組：Sham+Air組、Sham+0.5MAC ISO+60%Oxy組、Sham+0.5MAC SEV+60%Oxy組、CLP+Air組、CLP+0.5M

10、ACISO+60%Oxy組和CLP+0.5MAC SEV+60%Oxy組。CLP組動物采用盲腸結(jié)扎穿刺法建立膿毒癥模型，Sham組不進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)。治療組動物于CLP或Sham術(shù)后1h、6h分別給予0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧氣吸入1h，或在CLP或Sham術(shù)后6h給予動物0.5MAC七氟醚復(fù)合60%氧氣吸入2h。非治療組動物直接吸入空氣，作為對照。觀察動物7天存活情況。于老齡鼠CLP術(shù)后24h取材，包括取一側(cè)肺，做HE染色后觀察

11、病理損傷情況；取另一側(cè)肺，計算肺濕干比，評價肺水腫程度；進(jìn)行肺泡灌洗，收集灌洗液后檢測蛋白漏出；從右心室取血，離心后收集血清檢測炎癥因子、生化指標(biāo)等；收集腹腔灌洗液，離心后收集上清，檢測炎癥因子；于股動脈處取血，立即送檢進(jìn)行血氣分析。
　　結(jié)果:
　　實驗1．100%氧及0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧可顯著提高膿毒癥小鼠存活率，抑制CLP所致異常的炎癥反應(yīng)，改善氧合情況，并增強細(xì)菌清除能力。給予NO合成酶抑制劑后，上述治療效

12、應(yīng)均被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，NO參與了100%氧和0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧治療膿毒癥效應(yīng)機制。
　　實驗2．用慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞，高表達(dá)miR-133a-3p、miR-3074-2-3p、miR-542-3p后，0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧抑制LPS所致異常炎性反應(yīng)的效應(yīng)被部分逆轉(zhuǎn)。其次，用慢病毒感染 CLP小鼠外周血白細(xì)胞，高表達(dá) miR-133a-3p、miR-3074-2-3p、miR-542-3p后，0.

13、5MAC異氟醚復(fù)合對CLP所致異常炎性反應(yīng)的抑制效應(yīng)也被部分逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示，miRNAs參與氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機制。
　　實驗3．LPS刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平增高，給予100%氧和0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧干預(yù)后，細(xì)胞p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。這些結(jié)果提示，100%氧和0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧是通過抑制IKKα/β、IκBα、p

14、65蛋白磷酸化，從而抑制NF-κB激活，發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。
　　實驗4．LPS刺激RAW264.7細(xì)胞2h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子水平明顯增高，細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。給予100%氧或0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧干預(yù)后，可抑制LPS刺激后炎性因子水平的增高，細(xì)胞Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)水平升高，細(xì)胞漿中Nrf2蛋白表達(dá)有降低趨勢，而細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)增高，入核明顯增多；細(xì)胞總蛋

15、白中HO-1的蛋白表達(dá)升高。這些結(jié)果表明，100%氧和0.5MAC異氟醚復(fù)合60%氧干預(yù)治療離體膿毒癥效應(yīng)與Nrf2/HO-1抗炎通路密切相關(guān)。
　　實驗5.對于老齡SD大鼠及青年SD大鼠，CLP組后7天生存率均明顯低于Sham組，而給予0.5MAC異氟醚或七氟醚復(fù)合60%氧干預(yù)后，動物7天存活率均顯著提高。在老齡SD大鼠CLP后24h進(jìn)行取材并發(fā)現(xiàn)，CLP組老齡鼠的肺組織出現(xiàn)明顯病理性損傷，血清及腹腔灌洗液中炎癥因子和生化指標(biāo)水

16、平均明顯高于Sham組；給予0.5MAC異氟醚或七氟醚復(fù)合60%氧干預(yù)均可顯著改善肺損傷，并減輕CLP后炎癥因子、生化指標(biāo)、動脈血氣等各項指標(biāo)的異常改變。這些結(jié)果說明，氧醚復(fù)合對老齡鼠膿毒癥模型具有治療效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　我們的研究結(jié)果表明：NO參與了氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機制；miRNAs參與氧醚復(fù)合治療膿毒癥效應(yīng)機制；氧醚復(fù)合是通過抑制 IKKα/β、IκBα、p65蛋白磷酸化，抑制NF-κB激活，從而發(fā)揮其抗炎效應(yīng)