細胞焦亡參與高氧治療膿毒癥作用機制的初步研究.pdf

1、膿毒癥被定義為一種全身炎癥反應綜合征，由感染因素誘發(fā)，而嚴重膿毒癥是指伴有器官功能障礙的膿毒癥。在我國，膿毒癥常常導致高死亡率和高治療費用，已成為危害人類健康的主要疾病之一。因此，對于膿毒癥的有效救治策略的尋找迫在眉睫！前期我們小組在離體和在體模型上均證實，對于膿毒癥的治療方面，100％氧起了保護效應，膿毒癥后異常的炎性反應減弱，脂多糖刺激后NF-κB（Nuclear factor Kappa B，核因子-κB）核轉(zhuǎn)位的水平降低，膿毒癥

2、之后部分的miRNA的上調(diào)也被逆轉(zhuǎn)。膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中會伴隨大量的細胞死亡，后者是導致過度炎性反應紊亂的主要原因之一，近年來，宿主細胞死亡與膿毒癥之間關(guān)系的研究備受關(guān)注。細胞焦亡，或者稱之為依賴于caspase-1的細胞死亡，本質(zhì)上是由很多病理性刺激引起的炎癥反應，這些病理性刺激包括中風、心臟病或者癌癥。而細胞焦亡在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展和氧保護中的機制還未見研究，本研究擬在前期預實驗的基礎(chǔ)上，研究盲腸結(jié)扎穿刺（CLP，cecal lig

3、ation and puncture）所致小鼠膿毒癥模型與細胞焦亡以及在高氧治療膿毒癥效應機制中的作用，并通過離體實驗探索高氧治療膿毒癥效應中對NLRP3炎性小體炎癥通路的相關(guān)調(diào)控方式，以此為高氧治療膿毒癥提供更多的實驗依據(jù)，也將為尋找膿毒癥治療策略提供新的可能靶點。
　　研究目的：
　　探討焦亡與膿毒癥的關(guān)系以及焦亡與高氧治療膿毒癥效應的關(guān)系，并在骨髓源性巨噬細胞上驗證40%、60%以及100%不同濃度的氧氣對膿毒癥的治療

4、效應。
　　材料與方法：
　　第一部分
　　實驗1.將小鼠隨機分為2組：Sham組和CLP組。CLP組動物使用盲腸結(jié)扎穿刺法建立膿毒癥模型，Sham組動物只開腹，不實施盲腸結(jié)扎穿刺。24h后收集右下肺組織做Western Blot檢測。觀察指標：caspase-1活化片段P10與pro-caspase-1比值。
　　實驗2.將小鼠隨機分為4組：Sham組、CLP組、CLP+DMSO組、CLP+VX-765組。Sh

5、am組只開腹，后三組使用盲腸結(jié)扎穿刺法建立膿毒癥模型。動物在CLP術(shù)后1.5h分別給予caspase-1抑制劑VX-765和DMSO。術(shù)后24h收集右下肺組織、肝組織右下葉和右腎做HE病理染色切片。
　　實驗3.將小鼠隨機分為6組：Sham組、Sham+100%Oxy組、CLP組、CLP+40%Oxy組、CLP+60%Oxy組、CLP+100%Oxy組。前兩組只開腹，后四組使用盲腸結(jié)扎穿刺法建立膿毒癥模型。治療組在術(shù)后1h、6h分

6、別給予40%、60%和100%氧吸入1h；非治療組直接吸入空氣。24h后收集血清檢測炎性因子IL-1β水平。第二部分
　　實驗1.培養(yǎng)小鼠骨髓源性巨噬細胞（BMDMs），隨機分為4組：Control組、LPS組、ATP組、LPS/ATP組。LPS組單獨給予LPS刺激24h；ATP組單獨給予ATP刺激4h；LPS/ATP組使用LPS刺激細胞24h，再用ATP刺激細胞4h；Control組給予正常培養(yǎng)基。收集細胞培養(yǎng)上清液檢測IL-1

7、β水平。
　　實驗2.培養(yǎng)小鼠BMDMs，隨機分為6組：Control組、LPS組、ATP組、LPS/ATP組、LPS/ATP+YVAD組、LPS/ATP+DMSO組。刺激方法同實驗1；LPS/ATP+YVAD組在ATP刺激之前用caspase-1抑制劑AC-YVAD-CMK刺激0.5h；LPS/ATP+DMSO組在ATP刺激之前用DMSO刺激0.5h。收集細胞培養(yǎng)上清液檢測炎性因子IL-1β水平。
　　實驗3.培養(yǎng)小鼠BM

8、DMs，隨機分為7組：Control組、LPS組、ATP組、LPS/ATP組、LPS/ATP+40%Oxy組、LPS/ATP+60%Oxy組、LPS/ATP+100%Oxy組。刺激方法同實驗1。治療組細胞在ATP刺激0.5h后即開始給予40%、60%或100%氧治療1.5h。收集細胞培養(yǎng)上清液檢測IL-1β水平。
　　實驗4.實驗分組同實驗3。除ATP刺激1.5h之外其余刺激同實驗3。治療組細胞在ATP刺激后即開始給予40%，60

9、%或100%氧治療1.5h。ATP刺激1.5h后用EtBr和Hoechst33342熒光染色，熒光顯微鏡下觀察焦亡小孔的數(shù)量。
　　實驗5.培養(yǎng)小鼠 BMDMs，隨機分為5組：Control組、LPS/ATP組、LPS/ATP+40%Oxy組、LPS/ATP+60%Oxy組、LPS/ATP+100%Oxy組。LPS/ATP組使用LPS刺激細胞24h，再用ATP刺激細胞2h。治療組細胞在ATP刺激后即開始給予40%，60%或100%

10、氧治療1.5h。ATP刺激2h后，收集細胞用試劑盒檢測細胞內(nèi)鉀離子的水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　實驗1． CLP后24h，小鼠的右下肺組織細胞發(fā)生焦亡的程度明顯高于Sham組（P＜0.05）。
　　實驗2．CLP后24h，與Sham組相比，膿毒癥小鼠肺、肝和腎臟發(fā)生顯著病理性改變（P＜0.001）。與DMSO溶劑對照組相比，VX-765組的小鼠肺（P＜0.01）、肝和腎臟（P＜0.001）發(fā)生病理性改變

11、的程度減輕。
　　實驗3．CLP后24h，小鼠血清中IL-1β水平高于Sham組（P＜0.05），40%（P＜0.001）、60%或100%（P＜0.01）高濃度氧氣干預后小鼠血清中IL-1β水平降低。第二部分
　　實驗1．與Control組相比，LPS組和ATP組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平稍有升高，但無統(tǒng)計學意義。LPS/ATP組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）。
　　實驗2.前四組結(jié)果同實

12、驗1。相比于LPS/ATP組，AC-YVAD-CMK組IL-1β水平明顯降低（P＜0.001），DMSO組IL-1β水平明顯升高（P＜0.001）。
　　實驗3．前四組結(jié)果同實驗1。相比于LPS/ATP組，60%和100%高氧干預組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平明顯降低（P＜0.001）。
　　實驗4．與Control組相比，LPS組和ATP組有焦亡小孔形成的細胞數(shù)量比例并無明顯變化。LPS/ATP組有焦亡小孔形成的細胞數(shù)量

13、比例明顯升高（P＜0.001）。相比于LPS/ATP組，40%、60%或100%高氧干預組有焦亡小孔形成的細胞數(shù)量比例明顯降低（P＜0.001）。
　　實驗5．與Control組相比，LPS/ATP組細胞內(nèi)鉀離子的濃度無明顯變化。相比于LPS/ATP組，40%、60%或100%高氧干預組鉀離子的濃度無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果表明：在小鼠膿毒癥模型中有細胞焦亡參與組織損傷，高氧吸入可以通過減少焦亡小孔的