新的胃癌細胞系的建立和胃癌干細胞異質(zhì)性研究.pdf

1、胃癌的死亡率一直居高不下，其5年生存率徘徊在20％～30％;其中，胃印戒細胞型胃癌，因其生物學(xué)行為復(fù)雜、異質(zhì)性強、治療反應(yīng)率低，成為腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。腫瘤干細胞因其多向分化能力和自我更新能力，被認為是腫瘤異質(zhì)性、治療反應(yīng)率低和復(fù)發(fā)的根源，而靶向腫瘤干細胞治療被認為能夠從根源上治療腫瘤，防止復(fù)發(fā)。本研究將著重闡明胃癌細胞系中是否存在明顯差異的干細胞亞群，并建立一個理想的富含干細胞的胃癌細胞系模型和有明顯異質(zhì)性的干細胞亞群模型，在

2、此模型基礎(chǔ)上探討個體化治療并初步探討干細胞的調(diào)控機制，篩選重要的調(diào)控因子，達到靶向干細胞治療的目的。
　　第一部分:為了深入了解胃印戒細胞癌的生物學(xué)行為并篩選個體化治療的藥物，我們建立了病人來源的腫瘤移植模型（patient-derived tumor tissue，PDTT）及同一病人來源的胃印戒細胞癌的細胞系，命名為GCSR1。多種生物學(xué)行為特征鑒定結(jié)果顯示GCSR1核分裂多見，核邊聚，呈現(xiàn)印戒細胞樣形態(tài)。細胞周期時相S期細胞

3、比例、瓶壁和軟瓊脂集落形率分別為25％、24.13％和10％，呈現(xiàn)較強的體外生存能力。GCSR1細胞系經(jīng)連續(xù)傳至80代左右，細胞形態(tài)、生長曲線和倍增時間、細胞周期、集落形成能力等性狀仍保持相對穩(wěn)定。干細胞表型研究發(fā)現(xiàn)，GCSR1高表達干細胞表面標(biāo)記蛋白CD44和CD133，并且有很強的體內(nèi)成瘤能力，提示GCSR1富含胃癌干細胞。綜上所述，我們建立了一株穩(wěn)定的富含腫瘤干細胞的胃印戒細胞癌細胞系GCSR1。
　　第二部分:為了篩選指導(dǎo)

4、臨床治療的有效化療藥物，我們結(jié)合細胞系GCSR1和PDTT模型對4種一線化療藥物進行了篩選。結(jié)果提示:GCSR1細胞系多藥耐受，僅對化療藥物表阿霉素(EPI)敏感。結(jié)合第一二部分結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)GCSR1富含干細胞且多藥耐受。
　　第三部分:為了明確GCSR1細胞系中干細胞和耐藥的關(guān)系，并排除異質(zhì)性對后續(xù)研究的干擾，我們通過有限稀釋法從GCSR1細胞系中分離培養(yǎng)9個細胞亞群。通過流式細胞術(shù)和微球形成兩種方法篩選干細胞特性差異明顯的細

5、胞亞群，結(jié)果表明其中一個細胞亞群GCSR1-6高表達表面標(biāo)記CD133，微球形成能力明顯，具有明顯的干細胞表型;同時還存在一株干細胞特性較弱的細胞亞群，被命名為GCSR1-11。同時還發(fā)現(xiàn)GCSR1-6與GCSR1-11相較，運動能力更強，生長更緩慢，惡性程度更高。最重要的是GCSR1-6出現(xiàn)明顯的5-FU耐受，而GCSR1-11對5-FU敏感，結(jié)果提示我們GCSR1-6是GCSR1對5-FU耐受的主要細胞群。綜上所述，GCSR1-6是

6、一株惡性程度非常高的具有明顯干細胞特性的細胞亞群，是GCSR1細胞系耐藥的主要細胞亞群，與GCSR1-11細胞亞群相比，異質(zhì)性非常明顯。因而靶向治療GCSR1-6細胞亞群可能可以達到克服耐藥，提高治療效果的目的。為了達到這個目的，我們初步探討了GCSR1-6細胞亞群調(diào)控的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)錄因子β-catenin在GCSR1-6細胞核內(nèi)高表達，下調(diào)β-catenin表達后，GCSR1-6細胞形態(tài)發(fā)生改變，凋亡增加，干細胞標(biāo)記CD44下調(diào)

7、。結(jié)果提示，β-catenin是參與干細胞調(diào)控的重要蛋白。
　　第四部分:為了進一步闡述GCSR1-6和GCSR1-11細胞亞群的基因表達異質(zhì)性并深入研究干細胞調(diào)控的分子機制，我們進行了RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序研究，初步分析的結(jié)果提示，按照P＜0.05，log2(Fold change)絕對值＞1的標(biāo)準(zhǔn)，共有328個基因在GCSR1-6和GCSR1-11中差異表達。其中153個基因在GCSR1-6中高表達，175個基因在GCSR1