胃癌細(xì)胞來(lái)源的exosomes對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討胃癌細(xì)胞來(lái)源的exosomes對(duì)人臍帶來(lái)源間質(zhì)干細(xì)胞(humanum bilica lcordmesenchyma lstemcells,hucMSCs)的作用及其機(jī)制,研究腫瘤可以通過(guò)分泌exosomes的方式作用于腫瘤微環(huán)境細(xì)胞從而促進(jìn)其自身的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
　　 方法:利用超濾及蔗糖密度梯度離心法從胃癌細(xì)胞(SGC7901和HGC27)培養(yǎng)上清中分離并純化exosomes,通過(guò)透射電鏡觀察形態(tài)和大小圾Western

2、-blot檢測(cè)exosomes標(biāo)志性蛋白CD9、CD81對(duì)其進(jìn)行鑒定;體外實(shí)驗(yàn)將分離純化的腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosomes對(duì)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞作用(hucMSCs),首先用激光共聚焦和免疫組化檢測(cè)觀察腫瘤exosomes在hucMSCs中的內(nèi)化和定位。綜合運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞exosomes對(duì)hucMSCs增殖的影響;劃痕試驗(yàn)和transwell試驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞exosomes對(duì)hucMSCs遷移能力的影響;定量PCR(qRT-PCR)

3、、Westernblotting及免疫熒光等技術(shù)分析腫瘤細(xì)胞exosomes對(duì)hucMSCs的誘導(dǎo)分化作用及TGF-β信號(hào)通路在其中發(fā)揮的重要作用,探討腫瘤exosomes對(duì)MSCs生物學(xué)作用的機(jī)制。
　　 結(jié)果:采用超濾及梯度離心法成功分離純化得到腫瘤細(xì)胞分泌的exosomes,透射電子顯微鏡下觀察exosomes呈橢圓或碟狀的囊泡結(jié)構(gòu),直徑約30～100nm。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosomes表達(dá)標(biāo)志性蛋白CD9、CD81;胃癌

4、細(xì)胞來(lái)源的exosomes內(nèi)化和定位于hucMSCs;胃癌細(xì)胞來(lái)源的exosomes作用后hucMSCs細(xì)胞數(shù)明顯增加且其遷移能力增加;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Westernblot顯示在胃癌細(xì)胞來(lái)源exosomes作用下hucMSCs的CAFs標(biāo)志性基因和蛋白FAP、α-SMA、Vimentin、N-Cadherin表達(dá)增加;胃癌細(xì)胞來(lái)源exosomes作用hucMSCs后,TGF-β通路中的磷酸化Smad2/3和p38均增加而總的

5、Smad2/3和p38沒(méi)有變化:TGF-βRI抑制劑SD208作用后Smad2/3和p38的活化表達(dá)受到抑制。說(shuō)明胃癌細(xì)胞來(lái)源的exosomes在體外能促進(jìn)hucMSCs的生長(zhǎng),促進(jìn)其遷移且能誘導(dǎo)hucMSCs向CAFs的分化且TGF-β通路在此過(guò)程發(fā)揮重要作用,為研究腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供新的思路。
　　 結(jié)論:采用超濾及梯度離心法可以成功從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離純化exosomes。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的exosomes在體外能夠腫瘤