大菱鲆腦細(xì)胞系和精巢細(xì)胞系的建立與鑒定.pdf

1、魚類細(xì)胞系作為一種重要的研究工具已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、魚類資源保護(hù)與遺傳育種、內(nèi)分泌學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及生理學(xué)等研究中[1]。自Wolf和Quimby(1962)建立的第一個(gè)魚類細(xì)胞系-虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系RTG-2以來，迄今已建立了包括淡水魚類、海水魚類和溯河洄游性魚類的不同組織來源包括鰭條、皮膚、腮、肝臟、腎臟、脾臟、性腺、胚胎等的細(xì)胞系超過400余株。相較于活體魚，魚類細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)體系有著如下的優(yōu)點(diǎn)：不僅材料容易獲得

2、,降低了實(shí)驗(yàn)成本，還具有重復(fù)性好,實(shí)驗(yàn)條件可以精確控制等優(yōu)勢(shì)。因此,魚類細(xì)胞系不僅對(duì)于基礎(chǔ)研究,還是對(duì)于實(shí)際應(yīng)用都具有重要應(yīng)用價(jià)值。
　　大菱鲆屬輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鰈形目（Pleuronectiformes）、鰈亞目(Pleuronectoidei)、菱鲆科(Scophthalmidae)，是當(dāng)前歐洲和亞洲被廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類之一。目前見諸報(bào)道的大菱鲆細(xì)胞系有胚胎細(xì)胞系、鰭細(xì)胞系、頭腎細(xì)胞系、心臟細(xì)胞系，尚

3、未見其腦細(xì)胞系和精巢細(xì)胞系建立的報(bào)道。本研究通過組織塊培養(yǎng)法，以大菱鲆腦組織為材料，建立了大菱鲆腦細(xì)胞系(S.maximus brain cell line,SMB)；以大菱鲆精巢組織為材料，建立了大菱鲆精巢細(xì)胞系(S.maximus testis cell line,SMT)。培養(yǎng)SMB和SMT細(xì)胞系所用的培養(yǎng)基均是在DMEM/F12基本培養(yǎng)基中添加了Hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethan

4、esmLfonic acid)、抗生素(青鏈霉素)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和β-巰基乙醇(2- mercaptoethanol,2- ME)所配成的完全培養(yǎng)基。SMB細(xì)胞由上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞構(gòu)成，至今已傳40余代。SMT細(xì)胞主要由成纖維樣細(xì)胞構(gòu)成，生長(zhǎng)分裂旺盛，至今也已傳40余代。探究溫度對(duì)其生長(zhǎng)的影響，

5、結(jié)果表明，兩個(gè)細(xì)胞系在18~30℃均能正常生長(zhǎng)，在30℃時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快。核型分析顯示，兩個(gè)細(xì)胞系均出現(xiàn)了染色體非整倍性，說明兩個(gè)細(xì)胞系的染色體已出現(xiàn)丟失、斷裂或畸變，但其仍保持特征性染色體數(shù)44條。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功的將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreen fluorescent protein，EGFP）報(bào)告基因轉(zhuǎn)入兩個(gè)細(xì)胞系中均成功地獲得了表達(dá)，轉(zhuǎn)染率約為30％。通過提取兩個(gè)細(xì)胞系基因組DNA，克隆線粒體細(xì)胞色素C氧

6、化酶Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因片段，與NCBI上已公布的大菱鲆COⅠ基因序列相比對(duì)，二者與大菱鲆的同源性在99%以上，證明這兩個(gè)細(xì)胞系來源于大菱鲆。
　　牙鲆（日本牙鲆）又名褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，隸屬鰈形目(Pleuronectiformes),鲆科(Paralichthyidae)，牙鲆屬(Paralichthys)，多分布于北太平洋西部，中國(guó)北方、

7、韓國(guó)等海域被廣泛養(yǎng)殖。在牙鲆養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，也面臨著病害發(fā)生頻繁、種質(zhì)退化、抗病優(yōu)良品種缺乏等突出問題。建立牙鲆相關(guān)組織細(xì)胞系也可為遺傳育種提供良好的材料。本文用胰酶消化法和組織塊培養(yǎng)法啟動(dòng)原代培養(yǎng)對(duì)牙鲆脾臟、肝臟、腎臟等組織的離體培養(yǎng)做了初步研究，摸索了為牙鲆部分組織離體培養(yǎng)的合適的培養(yǎng)基條件。
　　綜上所述，本研究通過組織塊培養(yǎng)法成功建立了大菱鲆大菱鲆腦細(xì)胞系(S.maximus brain cell line, SMB