骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)UUO模型腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用研究.pdf

1、目的: 建立小鼠單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型，觀察外源性小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）輸注后UUO小鼠腎功能的改變，EPCs在腎組織的分布及對(duì)UUO模型中腎臟微血管損傷的干預(yù)作用，探討EPCs在UUO模型修復(fù)中的作用及其機(jī)制，為干細(xì)胞治療腎臟纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法: 貼壁細(xì)胞分離法和密度梯度離心法相結(jié)合分離純化小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞, 體外培養(yǎng)至14天時(shí)，免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，取第3代EPCs采用活體染料羧基熒

2、光素乙酰乙酸(CFDA-SE)標(biāo)記備用。72只小鼠隨機(jī)分成三組：（1）正常對(duì)照組（Control）組(n=24) ：觀察正常小鼠腎功能和腎臟結(jié)構(gòu)；（2）單側(cè)輸尿管梗阻模型組（UUO組）(n=24): 小鼠采用水合氯醛腹腔注射麻醉后，于左側(cè)中腹部切開皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在腎盂處和輸尿管上1／3處用絲線結(jié)扎后，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。建立UUO模型，同時(shí)經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水;(3)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組（EPCs移植組）(n=24) :同

3、上方法建立UUO模型，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射CFDA-SE標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞懸液（2×106個(gè)細(xì)胞/只）。建模后1天，3天，7天，14天隨機(jī)選取UUO組和EPCs移植組小鼠各六只，處死后留取血標(biāo)本和腎臟標(biāo)本。全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)腎功能指標(biāo)血尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）；石蠟切片行HE及Masson染色觀察腎組織的病理改變;冰凍切片行熒光顯微鏡觀察；免疫組化檢測(cè)HIF-1α、VEGF的表達(dá)及CD34標(biāo)記的腎小管周圍微血管密度（Peritu

4、bular capillaries，PTC）和腎小球微血管密度的變化。
　　 結(jié)果:
　　 （1）細(xì)胞培養(yǎng)至14d時(shí)，免疫熒光Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染陽(yáng)性的細(xì)胞陽(yáng)性率99％；免疫細(xì)胞化學(xué)示CD34(+),CD31(+),KDR(+)。CFDA-SE標(biāo)
　　
　　 記的內(nèi)皮祖細(xì)胞熒光顯微鏡下見胞漿內(nèi)有綠色熒光，陽(yáng)性率(95．8±1.6)％。
　　 （2）骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植定

5、位:在移植EPCs后1，3，7，14天小鼠梗阻腎臟冰凍切片上，可以見到腎小管上皮細(xì)胞區(qū)有CFDA-SE (+)內(nèi)皮祖細(xì)胞;在相應(yīng)小鼠對(duì)側(cè)腎臟及注射生理鹽水的UUO組小鼠腎臟均未見CFDA-SE (+)內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 （3）三組小鼠四個(gè)時(shí)間點(diǎn)靜脈血尿素氮、肌酐水平的變化：三組小鼠四個(gè)時(shí)間點(diǎn)靜脈血尿素氮、肌酐水平統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 （4）免疫組化結(jié)果：UUO組和EPCs移植組PTC密度在3天、7天、14天

6、較同期對(duì)照組表達(dá)均明顯減少，EPCs移植組在7天、14天與UUO組比較表達(dá)有所增多。UUO組及EPCs移植組第14天腎小球微血管密度較同期對(duì)照組明顯減少，EPCs移植組較UUO組表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。第1天時(shí)UUO組和EPCs移植組VEGF表達(dá)呈增高趨勢(shì)，3天、7天、14天時(shí)UUO組VEGF表達(dá)明顯減少，而EPC移植組較UUO組改善明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。HIF-1α在7天和14天UUO組

7、較對(duì)照組明顯增加，EPCs移植組較UUO組有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 （1）單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型出現(xiàn)腎臟微血管密度減少，繼而HIF-1α表達(dá)增加，VEGF表達(dá)下降可能是微血管損傷的原因。
　　 （2）在小鼠腎間質(zhì)纖維化過程中，經(jīng)鼠尾靜脈注射的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞可以靶向定位到梗阻腎臟對(duì)腎臟微血管損傷有保護(hù)作用。其保護(hù)作用機(jī)制可能是通過提高腎臟VEGF的表達(dá)、保護(hù)腎臟微血管內(nèi)