小鼠骨髓高增殖潛能內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)與促增殖因子研究.pdf

1、目的：用含小鼠骨髓內(nèi)皮細胞系條件培養(yǎng)液（BMEC—CM）的培養(yǎng)體系，進行骨髓高增殖潛能內(nèi)皮祖細胞（HPP—EPC）及其后代細胞的培養(yǎng)和純化，建立這些細胞的一種擴增培養(yǎng)方法。檢測小鼠骨髓內(nèi)皮細胞系細胞的血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）mRNA表達水平，分析BMEC—CM促進EPC增殖的分子機理。 方法和結(jié)果：本實驗分為以下三個部分： 1.總EPC集落形

2、成實驗制備小鼠骨髓單細胞懸液，骨髓細胞預(yù)貼壁培養(yǎng)6h后，吸出含未貼壁細胞的上懸液，移入新的培養(yǎng)瓶，并添加BMEC—CM，進行二次貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后用胰酶法將貼壁細胞消化下來，洗滌后計數(shù)。以每m㎡孔底面積1個細胞（1/mm2）的密度，將這些細胞種入培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系中仍添加BMEC—CM。觀察貼壁細胞集落的形成，計數(shù)集落數(shù)和計算集落形成率。數(shù)碼顯微拍攝集落，計數(shù)集落細胞數(shù)，用集落平均細胞數(shù)繪制細胞生長曲線，并計算細胞群體倍增時間（DT）。

3、 按原代骨髓細胞種植后的天數(shù)計，9～12d可見EPC細胞簇，2～3d內(nèi)形成集落（細胞數(shù)≥50），集落形成率為每106骨髓有核細胞生成600.0±52.4個集落（個/106NBMCs）。集落細胞大多呈橢圓形、圓形和紡錘形。大部分集落約在1周內(nèi)生長較快，以后生長減慢，至30d左右，集落平均細胞數(shù)為504.6±126.0。在原代骨髓細胞種植后10～13d、14～17d、18～21d、22～25d四個時間段的細胞群體倍增時間依次是58.

4、0h、74.4h、131.2h、358.2h。 2.HPP—EPC集落形成實驗及單集落源細胞的擴增培養(yǎng)和鑒定用上述消化和洗滌的貼壁細胞，以每m㎡孔底面積50個細胞（50/m㎡）的密度種入培養(yǎng)板，培養(yǎng)體系同前，每周換液。觀察貼壁細胞集落的形成，計數(shù)細胞數(shù)達5000左右的集落，計算集落形成率。進行單集落細胞擴增培養(yǎng)，每4d做細胞計數(shù)，按單個集落繪制細胞生長曲線和計算DT。用擴增細胞做CD31和vWF免疫熒光染色、FITC—UEA-1

5、結(jié)合實驗和Dil—Ac—LDL攝取實驗。 按原代骨髓細胞種植后的天數(shù)計，28～35d時細胞數(shù)5000左右的HPP—EPC集落形成，其細胞緊密聚集，細胞形態(tài)大多為橢圓形和圓形，集落形成率為3.0±0.6個/106NBMCs。單集落源細胞傳代擴增培養(yǎng)顯示，細胞在低密度時可形成索狀和網(wǎng)狀排列，高密度時細胞呈鋪路石狀排列。在原代骨髓細胞種植后50～53d，DT最短，平均為51.2h；在74～77d時間段，DT延長至324.2h。至原代骨

6、髓細胞種植后80d左右，集落的平均細胞數(shù)達8.0×106±1.2×105個，這些細胞為CD31、vWF免疫熒光染色陽性，能結(jié)合FITC—UEA-1和吞噬Dil—Ac—LDL。 3.mBMEC細胞中三種細胞因子mRNA水平的檢測Trizol法提取小鼠骨髓內(nèi)皮細胞系細胞RNA，進行熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測VEGF、bFGF、IGF-1mRNA的表達水平。PCR結(jié)果顯示mBMEC細胞高水平表達VEGFmRNA和bFGFmRNA，