2型糖尿病家系血清蛋白組學(xué)研究.pdf

1、第一部分重慶地區(qū)2型糖尿病家系成員的代謝特征及代謝綜合征患病率分析 目的:了解重慶地區(qū)2型糖尿病(T2DM)家系成員的代謝特征以及代謝綜合征(MS)和其亞組分的患病率，尋找可能的遺傳標(biāo)志物。 方法:(1)選取重慶地區(qū)漢族人群中符合入選條件的T2DM家系。共納入406個(gè)家系，1824名研究對(duì)象，其中男788名，女1036名。家系組1606名，配偶組218名。研究對(duì)象測定人體測量學(xué)參數(shù)、血壓、血脂譜、超敏C-反應(yīng)蛋白(hsC

2、RP)、非酯化游離脂肪酸(NEFA)等，行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。(2)去除家系組中二級(jí)親屬、配偶組中有糖尿病(DM)家族史和患有DM的研究對(duì)象，將剩余成員分為T2DM組，無DM的一級(jí)親屬(FDR)組和對(duì)照組。比較臨床和代謝特征，以及MS及亞組分的患病率。 (3)將家系成員分成：nT2DM組(診斷F2DM。時(shí)間少于半年，未曾進(jìn)行過藥物治療)，IGT組(患有IGT的一級(jí)親屬)，F(xiàn)DR-N組(糖耐量正常的一級(jí)親屬)，Control-

3、N組(糖耐量正常且無DM家族史的配偶)，比較各組的臨床和代謝特征。 結(jié)果:(1)與對(duì)照組比較，F(xiàn)DR組OGTT后2h血糖、Homa-IR和TG顯著增加(P<0.05)，HDL-C顯著減低(P<0.05)。DI指數(shù)有減低的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。IGR、肥胖、腹型肥胖、高TG血癥、低HDL-C血癥、高血壓和MS在FDR組分別為34.3％、32.2％、33.1％、29.8％、28.9％、12.5％和23.5％，除高血壓

4、的患病率略低于對(duì)照組外，其他各項(xiàng)均高于對(duì)照組。FDR組患IGR的風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的2.39倍(P<0.01)，患低HDL-C血癥的風(fēng)險(xiǎn)是1.87倍(P<0.05)，患MS風(fēng)險(xiǎn)是2.3倍(P<0.05)。(2)T2DM組患者的代謝紊亂更加嚴(yán)重?；挤逝?、高TG血癥、低HDL-C血癥和高血壓的風(fēng)險(xiǎn)約為對(duì)照組的2.5倍(OR值分別為2.73、2.53、2.46和2.81，P<0.01)，患腹型肥胖的風(fēng)險(xiǎn)4倍左右(OR值為3.81，P<0.01)，患

5、MS風(fēng)險(xiǎn)是7倍(OR值為7.02，P<0.01)。(3)與Control-N組比較，F(xiàn)DR-N組hsCRP、TG和Homa-IR升高(P<0.05)，HDL-C降低(P<0.05)，NEFA有增高的趨勢。NEFA和hsCRP在nT2DM組和IGT組顯著增加(P<0.05)。 結(jié)論:T2DM家系中非糖尿病一級(jí)親屬已表現(xiàn)出不同程度的代謝紊亂。T2DM家系的家族聚集性不僅表現(xiàn)為高血糖的聚集性，還表現(xiàn)為肥胖、高血壓、脂代謝紊亂等MS亞組

6、分的聚集性。TG、HDL-C、Homa-IR和炎性因子hsCRP、NEFA的變化可能與遺傳因素有關(guān)。 第二部分血清雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)的建立與優(yōu)化 目的:建立和優(yōu)化血清雙向凝膠電泳一質(zhì)譜技術(shù)。 方法:應(yīng)用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit純化血清蛋白，去除白蛋白和IgG；采用固相pH梯度(IPG)、等電聚焦(IEF)為第一向、SDS-PAGE垂直電泳為第二向的雙向凝膠電泳

7、(2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)分析評(píng)價(jià)血清蛋白純化效果，同時(shí)對(duì)標(biāo)本預(yù)處理、等電聚焦和銀染等方面進(jìn)行了優(yōu)化。 結(jié)果:去除白蛋白(ALB)和IgG的預(yù)處理使血清2-DE圖譜的局部分辨率提高，同時(shí)由于上樣量的增加，有利于一些含量較低蛋白的質(zhì)譜鑒定。對(duì)標(biāo)本預(yù)處理、等電聚焦和銀染等方面進(jìn)行了優(yōu)化，建立了穩(wěn)定的、重復(fù)性較好，分辨率較高的血清雙向凝膠電泳．質(zhì)譜技術(shù)。 結(jié)論:本研究成功建立和優(yōu)化了血清蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)，為尋找疾病的

8、血清學(xué)標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。 第三部分應(yīng)用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)篩選與2型糖尿病家系相關(guān)血清蛋白質(zhì) 目的:以2型糖尿病家系為基礎(chǔ)，運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)尋找2型糖尿病家系的血清蛋白表達(dá)譜差異，并結(jié)合肽質(zhì)量指紋譜技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡鑒定差異蛋白質(zhì)，闡明差異蛋白與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，尋找2型糖尿病的遺傳標(biāo)志。 方法:(1)從重慶地區(qū)符合入選條件的漢族T2DM家系中選擇受試對(duì)象，分為四組：nT2DM組(診斷T2DM時(shí)間少于半年

9、，未曾進(jìn)行過藥物治療，男30例/女30例)、IGT組(男15例/女15例)、糖耐量正常的一級(jí)親屬組(FDR-N)(男30例/女30例)和糖耐量正常的無DM家族史配偶(Cnotrol-N)(男23例/女27例)為對(duì)照組。將每組的血清等體積混合上樣，然后隨機(jī)從每組選取4個(gè)樣本重復(fù)雙向電泳進(jìn)行驗(yàn)證，運(yùn)用PDQuest7.3.1軟件比較各組的2-DE圖，獲得差異蛋白點(diǎn)。(2)將差異蛋白點(diǎn)取出、酶解后，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF)，然

10、后采用Mascot和MS-Fit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索，找到差異蛋白。(3)收集nT2DM、IGT、FDR-N和Control-N正常對(duì)照組各10例病人，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證。 結(jié)果:(1)獲得了重復(fù)性較好的的四組2-DE圖譜。(2)通過PDOuest軟件比較四組的2-DE圖譜，得到了32個(gè)差異蛋白點(diǎn)。在nT2DM、IGT、FDR-N高表達(dá)的有13個(gè)，僅在nT2DM和IGT組高表達(dá)的蛋白點(diǎn)有11個(gè)，僅在nT2DM和IGT組低

11、表達(dá)的蛋白點(diǎn)有2個(gè)，僅在nT2DM組高表達(dá)蛋白點(diǎn)有3個(gè)，僅在nT2DM組表達(dá)的蛋白點(diǎn)有1個(gè)，在nT2DM組高表達(dá)，在IGT組低表達(dá)的有1個(gè)，對(duì)照組缺失的1個(gè)。(3)對(duì)全部的差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中，27個(gè)蛋白點(diǎn)鑒定出9個(gè)蛋白，5個(gè)蛋白點(diǎn)未鑒定出。鑒定出的蛋白分別是C反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4b結(jié)合蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、ApoM、ApoAⅣ和ApoE。(3)選擇候選蛋白ApoM進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，ApoM在各組中

12、的無顯著性的變化。 結(jié)論:(1)首次運(yùn)用雙向電泳技術(shù)一質(zhì)譜技術(shù)尋找2型糖尿病家系的血清蛋白表達(dá)譜差異，獲得了9個(gè)差異蛋白，分別是C反應(yīng)蛋白、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4b結(jié)合蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、ApoM、ApoA Ⅳ和ApoE。(2)蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)印跡僅僅是初步的蛋白質(zhì)水平上的研究，ApoM與其他蛋白質(zhì)在T2DM家系中的變化還需要進(jìn)一步的確定。(3)這些蛋白在T2DM家系成員中的高表達(dá)，可能與T2DM家系