豬鏈球菌2型強(qiáng)、無毒毒株定量分泌蛋白組學(xué)研究.pdf

1、[目的]：
　　本文通過蛋白組學(xué)方法比較豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)強(qiáng)、無毒株分泌蛋白，分析二者蛋白表達(dá)的差異，以期進(jìn)一步了解SS2的致病機(jī)制明確該菌株間致病性存在差異的原因，對今后流行病學(xué)的調(diào)查有一定的指導(dǎo)意義。
　　[方法]：
　　本實(shí)驗(yàn)以SPF巴馬小型豬及野生型斑馬魚作為動(dòng)物模型，檢測了SS2菌株感染SPF巴馬小型豬后致病情況，并計(jì)算了接種斑馬魚96h內(nèi)LD50值，

2、確定實(shí)驗(yàn)菌株，強(qiáng)毒株SH-08和無毒株SH-07YH，并以該兩個(gè)菌株的基因組為模板，通過PCR的方法擴(kuò)增與毒力相關(guān)的基因cps、mrp、epf、gdh、orf2、gapdh、sly初步判定各個(gè)菌株的毒力因子攜帶情況。
　　根據(jù)各菌株培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)(CFU)結(jié)果，對SH-08及SH-07YH菌液，以每1h為間隔，按照倍比稀釋法進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)及OD600測定，繪制兩菌株生長曲線，比較細(xì)菌生長情況。在菌液OD600為0.4時(shí)(前對數(shù)期)，

3、收集菌株的表達(dá)上清。按照CFU值定量取SH-08及SH-07YH培養(yǎng)上清量（分別為50ml及76.5ml），并通過BCA技術(shù)進(jìn)行蛋白定量。隨后通過SDS-PAGE技術(shù)初步分析兩菌株分泌蛋白表達(dá)圖譜，評估后續(xù)定量蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。
　　首先通過胰酶分解上清蛋白，采用液質(zhì)聯(lián)用及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定研究(ThermoQuest)，隨后經(jīng)電噴霧方法，按照質(zhì)荷比為400至2000范圍進(jìn)行全掃描，經(jīng)SEQUEST軟件分析，將肽段信息與SW

4、ISSPORT數(shù)據(jù)庫中所有的鏈球菌種信息進(jìn)行匹配。運(yùn)用DeCyderMS軟件將肽段質(zhì)譜信息轉(zhuǎn)化為類似雙向電泳圖形式，評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量?；诙勘容^蛋白組學(xué)的結(jié)果，在強(qiáng)毒株SH-08中特異性和高表達(dá)的蛋白用PCR和RT－PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　采用在線免費(fèi)軟件SignaIP2.0.B2(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.01)進(jìn)行目的蛋白信號肽預(yù)測分析，含有信號肽蛋白通過PSORTI

5、(http://psort.nibb.ac.jp/)軟件進(jìn)一步分析目的蛋白的細(xì)胞定位。
　　選擇在強(qiáng)毒株SH-08及弱毒株SH-07YH中共表達(dá)，且在強(qiáng)毒株SH-08中表達(dá)上調(diào)的蛋白，將其定量蛋白數(shù)據(jù)及定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)線型回歸分析(SPSS16.0)，確定蛋白高表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]：
　　(1)動(dòng)物致病力實(shí)驗(yàn)，SPF巴馬小型豬在感染強(qiáng)毒株SH-08后均出現(xiàn)急性敗血癥并死亡，而無毒株SH-07YH

6、感染后只有輕微的發(fā)熱現(xiàn)象。斑馬魚(LD50)結(jié)果表明菌株SH-08的毒力遠(yuǎn)高于SH-07YH，明確了兩株細(xì)菌的致病力，為接下來的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)PCR方法擴(kuò)增與毒力相關(guān)基因，表明SH-08與背景已知的強(qiáng)毒株ZY05719所含的主要毒力基因一致，相比而言，無毒株SH-07YH僅缺失了毒力基因fbps，而其他大部分毒力基因都存在，推測毒力因子缺失并非是造成致病力差異的關(guān)鍵原因。
　　(3)SDS-PAGE電泳鑒定SH

7、-08與SH-07YH上清蛋白表達(dá)基本一致，但SH-08菌株存在更多的蛋白條帶，部分蛋白條帶表達(dá)量相比SH-07YH顯著上調(diào)。結(jié)果證實(shí)后續(xù)定量蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)具有可行性。
　　(4)本研究通過基于非標(biāo)定量蛋白組學(xué)方法，結(jié)合DecydeMS軟件進(jìn)行豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株SH-08及弱毒株SH-07YH分泌蛋白進(jìn)行定量研究，結(jié)果證實(shí)了相比弱毒株SH-07YH，強(qiáng)毒株SH-08含有11個(gè)高表達(dá)分泌蛋白，29個(gè)特異性分泌蛋白。推測這些差異表達(dá)的蛋

8、白可能與菌株毒力相關(guān)，為豬鏈球菌2型的毒力因子研究奠定了基礎(chǔ)，為后續(xù)致病機(jī)制研究提供借鑒。
　　[結(jié)論]：
　　(1)應(yīng)用野生型斑馬魚作為動(dòng)物模型，比較了SS2菌株ZY05719、SH-07YH和SH-08之間的LD50。其中ZY05719株LD50值最低，其次為SH-08株，SH-07YH株LD50值則最高。表明菌株SH-08的毒力遠(yuǎn)高于SH-07YH。
　　(2)本研究通過基于非標(biāo)定量蛋白組學(xué)方法，結(jié)合Decyde