人肝臟相關ConA和DSA結合型糖蛋白組學研究.pdf

1、第一部分：人健康肝刀豆凝集素(COn A)結合型糖蛋白組學研究 目的：隨著蛋白組學研究領域的急劇擴展，糖蛋白糖鏈結構與功能的研究是當前蛋白質組學發(fā)展后的重要延伸領域。在此我們選用可以識別二天線型和高甘露糖型結構的刀豆凝集素Con A通過固相親和層析的富集糖蛋白，通過雙向電泳、質譜技術來建立相對穩(wěn)定、標準的高通量糖蛋白質組學共性技術平臺，建立和分析人健康肝組織刀豆凝集素Con A結合型糖基化蛋白質數據庫，為后續(xù)工作奠定了基礎。

2、 方法：從人健康肝組織中提取總蛋白，通過刀豆凝集素(Con A)親和柱層析分離和濃集Con A結合型蛋白質，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和雙向電泳(2-DE)分離，建立人健康肝組織Con A結合型蛋白表達譜，應用基質輔助激光解吸飛行時間串聯質譜(MALDI-TOF-MS/MS)和數據庫搜索鑒定該圖譜中所有蛋白點。利用NetNGlyc和NetOGlyc軟件對鑒定的蛋白進行糖基化位點預測，應用生物信息學對這些蛋白進行Qui

3、ckGO搜索，依據三個主要的GeneOntology種類，即生物過程、分子功能和細胞內定位對它們分類分析。 結果：人健康肝組織中提取的總蛋白通過Con A親和層析柱分離為兩組份，柱不結合組分由非Con A結合型糖基化蛋白構成；柱結合組份由Con A結合型糖基化蛋白組成。兩組份與總蛋白進行SDS-PAGE，發(fā)現通過親和層析使得ConA結合的低豐度糖蛋白得到富集，在60KD處有一明顯濃集的條帶。對它們進行2-DE分離，并結合SYPR

4、O-Ruby熒光染色技術，獲得人健康肝組織Con A結合型蛋白表達譜，PDQuest7.0軟件探測到蛋白質點301±15個，分析圖譜發(fā)現較偏酸性端和堿性端， PI 3-5，MW 25-47KD區(qū)域處有多個高豐度蛋白，低分子量糖蛋白亦較多；切取130個蛋白點，應用MALDI-TOF-MS/MS進行鑒定，通過數據庫搜索及去冗余后，共鑒定85種蛋白。將這些蛋白進行糖基化位點預測，除5個蛋白僅具有O-連接糖基化位點外，其他蛋白均含有潛在N-連

5、接糖基化位點。應用生物信息學對這些蛋白進行分類，發(fā)現參與代謝通路及與細胞周期相關的蛋白分別占35％和22％，Con A結合型總糖蛋白以定位在細胞質和細胞核中為最多。 結論：(1)凝集素層析、2-DE聯合MALDI-TOF-MS/MS分析是相對穩(wěn)定的高通量糖蛋白質組學共性技術平臺，可用于大量樣本的疾病蛋白質組學中蛋白質糖基化修飾譜的研究，對發(fā)現與疾病發(fā)生、發(fā)展中相關的異常糖基化蛋白質有重要價值。(2)本研究建立了人健康肝組織Con

6、 A結合型蛋白蛋白數據庫。 第二部分： 目的：本部分我們利用已建立的凝集素親和層析技術平臺富集DSA結合型糖蛋白，通過雙向電泳和多維色譜兩種途徑進行分離，利用質譜鑒定獲得的糖蛋白數據來建立人健康肝組織及肝癌組織DSA結合型糖基化蛋白質數據庫，為正常狀態(tài)下，機體內糖蛋白的全面闡述提供基本生物學信息，為蛋白質多天線型糖鏈結構在體內功能研究提供理論依據。 方法：通過免疫熒光檢測DSA結合型糖蛋白在人正常肝細胞chang

7、’s liver中的表達和定位，從人健康肝組織及肝癌組織中提取總蛋白，通過蔓陀蘿凝集素(DSA)親和柱層析分離和濃集DSA結合型糖基化蛋白質，分別通過雙向電泳、糖蛋白染色復合總蛋白染色、基質輔助激光解吸飛行時間串聯質譜(MALDI-TOF-MS/MS)技術及通過二維色譜(2D-LC)、納升級電噴霧質譜(nESI-MS)技術對于親和層析所獲得的DSA結合型糖蛋白進一步的分離和鑒定，建立人健康肝組織及肝癌組織DSA結合型糖基化蛋白數據庫，并

8、對2-DE和2D-LC兩種分離方法進行比較。利用NetNGlyc軟件對鑒定的蛋白進行糖基化位點預測，應用生物信息學對這些蛋白進行QuickGO搜索并分類分析。 結果：免疫熒光發(fā)現DSA結合型糖蛋白定位于細胞膜、胞質及胞核內。通過10％N-乙酰葡萄糖胺寡聚體(Chintin)成功的從人健康肝組織及肝癌組織中總蛋白中分離并富集了DSA結合型糖蛋白，層析得率為4％。比較研究發(fā)現肝癌組織和正常肝組織呈現不同的SDS-PAGE和DSA凝

9、集素親和層析圖譜，2-DE電泳結合糖蛋白染色獲得人健康肝組織DSA結合型糖基化蛋白表達譜，ImageMaster軟件探測到蛋白質點60±3個，分析圖譜發(fā)現DSA結合型糖蛋白較偏酸性端，PI 4-7，MW 35-85 KD區(qū)域處有許多高豐度蛋白；切取糖蛋白質點進行鑒定，去冗余共鑒定出43種糖蛋白；通過2D-LC結合ESI-MS鑒定出人健康肝組織93種蛋白，其中有25種與2DE-MALDI-MS鑒定蛋白相同，且鑒定的分子量范圍較后者為廣，但

10、仍以偏酸性端的蛋白為多。此外ESI-MS鑒定出肝癌組織DSA結合型糖蛋白98種，與相同條件下鑒定的人健康肝組織蛋白有73種完全匹配，不匹配的點為45種。將這些蛋白進行糖基化位點預測，并應用生物信息學對這些蛋白進行分類，發(fā)現它們大部分都具有潛在的N-糖基化位點，在胞漿、胞膜及胞核中均有不同程度的分布，參與體內代謝和細胞粘附及細胞運動過程。與Con A結合型糖蛋白相比較，定位在內質網指導蛋白質折疊的分子伴侶類蛋白質較多。 結論：(1

11、)親和層析、2-DE、MP技術、MALDI-TOF-MS/MS四者結合及親和層析-二維色譜-電噴霧質譜分析是相對穩(wěn)定的高通量、糖蛋白質組學共性技術平臺。二維色譜可用于小樣本的蛋白質糖基化修飾譜研究。(2) 本研究建立了人健康肝及肝癌組織DSA結合型糖基化蛋白數據庫，用兩種方法共鑒定出人健康肝組織DSA結合型糖蛋白118種，通過2D-LC-ESI-MS共鑒定人肝癌組織DSA結合型糖蛋白98種。生物信息學分析發(fā)現DSA結合型的多天線結構的糖

12、蛋白對于細胞的識別黏附、蛋白質的折疊轉運等方面有著非常熏要的作用。 第三部分 人肝癌相關DSA結合型比較糖基化蛋白質組學研究 目的：通過差異熒光凝膠電泳(DIGE)技術比較研究健康肝和人肝癌細胞組織中DSA．結合型糖基化蛋白質表達譜的改變，篩查在肝癌發(fā)生中起重要作用的關鍵DSA結合型糖基化蛋白質分子，驗證其表達水平及推斷糖鏈結構改變，為肝癌癌變機制性研究奠定理論基礎。為疾病相關分子的糖蛋白質組學研究提供技術手段。

13、 方法：從人健康肝組織及肝癌組織中提取總蛋白，通過蔓陀蘿凝集素(DSA)親和柱層析分離和濃集DSA結合型糖基化蛋白質，分別以cy3和cy5熒光標記，以cy2做內標，通過差異熒光凝膠電泳技術在同一塊膠上進行分離，利用熒光掃描儀473、532、635三個通道進行掃描獲得的糖蛋白表達譜圖像經Decyder 2D 6.5軟件凝膠圖像分析軟件進行點識別、背景消除、點匹配及差異蛋白質分析，后續(xù)跑膠進行糖蛋白染色并挖點MALDI-TOF-MS質譜鑒

14、定。結合第二部分利用2D-LC．ESI-MS鑒定出的差異蛋白按照功能及參與通路進行生物信息學分析，并對一種差異蛋白波形蛋白Vimentin異常DSA糖基化進行再驗證；應用免疫印跡分析其蛋白表達情況；應用免疫沉淀結合多種凝集素親和印跡檢測這些蛋白與肝癌發(fā)生相關的其他糖鏈結構改變。 結果：雙向電泳結束后，473、532、635三個通道進行掃描獲得的內標圖譜、人健康肝組織DSA結合型糖蛋白表達譜、肝癌組織DSA結合型糖蛋白表達譜用分析

15、軟件(DeCyder 2D 6．5)進行批量分析，人健康肝組織中被檢測到的蛋白質點308±15個，肝癌組織中檢測到的有353±26個點。其中相匹配(所有圖譜共有的)有266個，不能相匹配的檢測點有41個，被認為是雜質微粒或者由實驗所帶來的隨機誤差。差異大于1.4倍以上的蛋白點有30個，經質譜鑒定出的差異蛋白點有26個，16個是在腫瘤中上調。綜合前面通過2D-LC鑒定出的差異蛋白進行生物信息學分析，發(fā)現在差異蛋白中以定位在內質網或高爾基

16、體中具有分子伴侶功能，并指導蛋白質的正確折疊及翻譯后修飾或與內質網應激相關的蛋白為最多。選擇Vimentin進行異常DSA結合型糖基化再驗證，它們在肝癌組織提取的DSA結合型糖基化蛋白中表達水平較正常肝組織要高。凝集素親和印跡法對Vimentin進行糖鏈結構推斷，發(fā)現Vimentin對Con A、DSA、LCA都具有親和力。且在肝癌組織中對DSA和Con A的親和力要增強。 結論：(1)凝集素親和層析結合DIGE技術聯合MALD