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文檔簡介
1、肝纖維化是所有慢性肝臟疾病形成的共同病理反應(yīng)過程,活化的肝星狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的增多是肝臟纖維化發(fā)病的最主要特征之一,肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖和活化是肝臟纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),抑制HSC的增殖和活化成為抗肝纖維化治療的重要手段之一。研究表明組蛋白甲基化在HSC的增殖活化過程中起到了很重要的作用,但具體機(jī)制尚不明確。為了更進(jìn)一步地探討組蛋白甲基化在肝纖維化形成過程中的重要作用及其機(jī)制,通過在體與離體兩個不同的角度,首先觀察
2、在肝纖維化組織中和活化的肝星狀細(xì)胞中與組蛋白甲基化有關(guān)的轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化情況,再觀察組蛋白甲基化有關(guān)的轉(zhuǎn)移酶對HSC增殖和活化的影響,最后更深一步地探討了其部分作用機(jī)制。本文主要研究內(nèi)容包括下面四個部分:
1. CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中EZH2和Dkk1的表達(dá)變化。
將40只大鼠分為正常組10只和模型組30只,取CCl4進(jìn)行腹腔注射用以建立大鼠肝纖維化的模型。模型組的大鼠以50%CCl4植物油溶液(1ml/kg)
3、進(jìn)行腹腔注射,每周注射2次,共注射12周;正常組以相同劑量植物油進(jìn)行腹腔注射,同樣每周注射2次,共注射12周。在12周結(jié)束后,處死實驗大鼠并獲取肝臟組織進(jìn)行H&E染色和Masson染色的檢測,并應(yīng)用Real-time PCR、Western Blot法和免疫組化法檢測分析α-SMA、EZH2和Dkk1在大鼠肝組織中的表達(dá)變化。實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn),EZH2在肝臟纖維化形成過程中表達(dá)升高,Dkk1在肝臟纖維化形成過程中表達(dá)降低。
2.
4、 TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中EZH2和Dkk1的表達(dá)變化。
實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,應(yīng)用10ng/ml TGF-?1分別刺激細(xì)胞24h和48h后,收取細(xì)胞,提取RNA和蛋白,應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot法檢測分析在TGF-β1刺激的HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、EZH2和Dkk1表達(dá)變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞中EZH2表達(dá)升高,Dkk1表達(dá)
5、降低。
3.抑制EZH2的表達(dá)可以阻抑TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖和活化。
1)實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,應(yīng)用MTT的方法檢測EZH2的抑制劑DZNep對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖活性的影響。實驗分為對照組、模型組、DZNep作用6h組、DZNep作用12h組、DZNep作用24h組和DZNep作用48h組。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),DZNep可以抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖,
6、抑制程度和DZNep濃度有關(guān)。實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,實驗可分組為對照組、模型組、陰性對照組和EZH2-siRNA實驗組。同樣應(yīng)用MTT法檢測 si-EZH2對 TGF-β1誘導(dǎo)的 HSC-T6細(xì)胞增殖活性的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),si-EZH2可以抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果說明,DZNep和si-EZH2導(dǎo)致的EZH2的表達(dá)沉默都可以抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖。
2)
7、實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,應(yīng)用10ng/ml TGF-?1刺激HSC-T6細(xì)胞30min后,加入1ng/ml的DZNep溫育24h,采用Real-time PCR方法檢測分析α-SMA和EZH2的mRNA表達(dá)變化;采用Western Blot法檢測分析α-SMA和EZH2的蛋白表達(dá)變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),DZNep可以抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的活化。同樣實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,依據(jù)EZH2基因序列設(shè)
8、計與合成EZH2的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)即si-EZH2,應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到HSC-T6細(xì)胞中。采用Real-time PCR方法檢測分析α-SMA和EZH2的 mRNA表達(dá)變化;采用Western Blot法檢測分析α-SMA和EZH2的蛋白表達(dá)變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),si-EZH2可以抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的活化。以上結(jié)果說明,DZ
9、Nep和si-EZH2導(dǎo)致的EZH2的表達(dá)沉默都可以抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的活化。
4.抑制EZH2表達(dá)后HSCs增殖活化被影響的部分機(jī)制研究。
1)實驗研究的對象選取 HSC-T6細(xì)胞,依據(jù) Dkk1的基因序列設(shè)計與合成Dkk1的小干擾RNA,應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到HSC-T6細(xì)胞內(nèi)。采用Real-time PCR方法檢測分析Dkk1和α-SMA的mRNA表達(dá)變化情
10、況;采用Western Blot法檢測分析Dkk1、β-catenin、C-myc、CyclinD1和α-SMA的蛋白表達(dá)變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默Dkk1促進(jìn)了由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖和活化。同樣實驗研究的對象選取 HSC-T6細(xì)胞,如前面所述應(yīng)用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表達(dá),采用Real-time PCR方法檢測分析Dkk1的mRNA表達(dá)變化情況;采用Western Blot法檢測分析Dkk1和H
11、3K27me3的蛋白表達(dá)變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),Dkk1的表達(dá)變化受到EZH2的調(diào)控。同樣實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,如前面所述應(yīng)用DZNep和si-EZH2抑制EZH2的表達(dá),采用Western Blot法檢測分析β-catenin、C-myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)變化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),EZH2介導(dǎo)的Dkk1的表達(dá)下降導(dǎo)致了Wnt/β-catenin通路的激活。同樣實驗研究的對象選取HSC-T6細(xì)胞,如前面所述采用DZ
12、Nep抑制EZH2的表達(dá),采用si-Dkk1抑制Dkk1的表達(dá),同時采用DZNep抑制EZH2的表達(dá)和采用si-Dkk1抑制Dkk1的表達(dá)。Real-time PCR方法檢測分析Dkk1和α-SMA的mRNA表達(dá)變化情況;Western Blot法檢測分析Dkk1、β-catenin、C-myc、CyclinD1和α-SMA的蛋白表達(dá)變化。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),Dkk1在EZH2介導(dǎo)的Wnt/β-catenin通路的激活中起到了重要的作用。以上
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