miR-206在組織中的分布和成肌分化過程中的表達及生物學作用的初步研究.pdf

1、各種創(chuàng)傷如車禍傷、槍彈傷、燒傷及部份內科疾病如糖尿病、腫瘤和癱瘓所致的肢體壞疽都常伴肌組織損傷，對于嚴重或面積較大的肌損傷或缺損，肌肉的再生相對困難，創(chuàng)面最終被纖維結締組織替代而形成瘢痕，導致機體運動功能障礙并累及神經、血管系統(tǒng)，影響患者的預后和生活質量。因此，如何促進大面積肌肉缺損后的修復，調控肌細胞分化的過程和其中的調控機制一直是創(chuàng)傷修復研究的熱點問題之一。 MicroRNA(miRNA)是一類長度為21～23核苷酸(nt)

2、的高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，它們一般通過Dicer酶從具有發(fā)夾二級結構的前體RNA加工而來，在生長發(fā)育、增殖分化、腫瘤發(fā)生和病毒感染等多種生物學事件中發(fā)揮了重要作用。以往，人們注意力主要集中于傳統(tǒng)的與蛋白質合成有關的三種RNA(mRNA、tRNA和r RNA)的研究，自從小RNA(主要包括miRNA和siRNA兩類)被發(fā)現(xiàn)之后，已經從人類和線蟲體內分別鑒定數百種miRNA，對擬南芥等植物基因組分析結果表明，miRNA大部分都作用

3、于與發(fā)育過程相關的轉錄因子，尤其與表型建立和細胞分化有關。miR-206最初是在從人和小鼠肌肉組織中克隆鑒定出來，長度為22nt，由73nt的莖環(huán)結構前體剪切加工成熟，其編碼基因定位于6號染色體，與miR-133簇集分布，核心序列與miR-1一致，基因芯片檢測提示miR-206在骨骼肌細胞分化成熟過程中表達呈現(xiàn)一定的時空特異性，這提示miR-206可能具有同miR-133和miR-1相關的促成肌分化功能，但其具體的生物學功能還未見詳細報

4、道。因此，在本實驗中我們首先檢測了miR-206在C57小鼠各組織臟器中的表達情況；然后利用C2C12細胞模擬體外成肌分化過程，觀測miR-206在成肌分化過程中的表達變化；克隆構建miR-206的腺病毒表達載體和合成化學修飾反義鏈，轉染C2C12細胞和骨髓間充質干細胞，使其在細胞中過表達或者抑制其表達的情況下，觀察對細胞成肌分化的影響，明確其生物學功能。主要的結果如下： 1．miR-206在C57小鼠的骨骼肌和心肌中呈強陽性表

5、達，小腸、脾臟、肺臟組織有少量表達，腦、腎臟、肝臟組織未見陽性表達，表明miR-206的分布具有組織特異性。 2．利用C2C12細胞在體外成功誘導其向成肌細胞分化，通過形態(tài)學觀察，RT-PCR、western-blot、細胞免疫熒光組織化學及流式細胞儀等方法進行檢測，證實我們所建立的細胞分化模型是成功的，并觀察到隨著誘導時間的延長，miR-206在成肌分化過程中表達量逐漸增高的，表達改變具有階段特異性。 3．成功克隆了

6、miR-206基因并構建到腺病毒表達載體中。利用PCR技術擴增出mi-206基因片段，通過T-A克隆連接至穿梭質粒pAdTrack-CMV中，然后轉化含骨架質粒pAdEasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，通過同源重組產生腺病毒載體質粒pAdEasy/miR-206，轉染293細胞后包裝出重組病毒載體Adv/mir-206病毒。提取轉染后的293細胞基因組DNA進行PCR反應，可成功擴增出354bp的目的片段，Northem-blot

7、顯示轉染后293細胞miR-206呈陽性表達。 4．miR-206的生物學功能的初步觀察：將Adv/miR-206轉染C2C12細胞，使其高表達miR-206，在未加入誘導劑的情況下，可見C2C12細胞向成肌細胞分化，有粗大多核的肌管形成，肌特異性相關蛋白MHC表達增加，而Adv/GFP空質粒轉染組則沒有此類變化，說明在無誘導劑的情況下，提高miR-206在C2C12細胞的表達水平也可以促進細胞向成肌方向分化。利用反義核酸技術將

8、miR-206反義鏈導入C2C12細胞后，再加入誘導劑進行誘導分化，其結果顯示導入反義鏈的C2C12細胞在加入誘導劑的情況下，向成肌分化的能力明顯減弱，誘導分化第2天計數胞體比C2C12細胞伸長2倍以上的細胞數比率，可見反義鏈轉染組為35％，而正常細胞誘導組為87％，說明在有誘導劑的情況下，阻斷了miR-206在C2C12細胞的表達可明顯降低C2C12向成肌方向分化的能力。因此，我們認為miR-206是參與成肌分化并且維持這種分化狀態(tài)的

9、一個關鍵性調節(jié)因子。 5．對Adv/miR-206轉染后的C2C12細胞進行流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)Adv/mi206轉染能夠促使C2C12的S期細胞比例明顯下降，退出細胞分裂周期，以利于其進入分化狀態(tài)，而Adv/GFP空載體轉染組C2C12細胞周期改變不明顯：Adv/miR-206轉染至MSC可見細胞形態(tài)伸長，雙核細胞比例明顯增加。由此，推測提高miR-206的表達可能模擬了發(fā)育過程中的某些信號，通過作用于細胞周期蛋白等因子，促使