牙鲆魚中特征miRNA(miR-206)富集技術(shù)的初探.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)且在進(jìn)化過(guò)程中保守的非編碼 RNA,其長(zhǎng)度一般為22 nt左右,主要通過(guò)沉默復(fù)合體降解或者阻遏靶mRNA的翻譯,在生物體內(nèi)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,其相關(guān)方面的研究已成為科學(xué)界增長(zhǎng)最快的新熱點(diǎn)。特別是近年來(lái)對(duì)動(dòng)物通過(guò)飲食攝入 miRNA(miR-168a)的研究發(fā)現(xiàn),植物miRNA可以通過(guò)飲食調(diào)控哺乳動(dòng)物的生理功能,miRNA作為全新的重要功效因子的地位已經(jīng)凸顯,但仍需大量關(guān)于這種跨“界

2、”作用的機(jī)理研究。隨著miRNA研究的不斷深入,對(duì)miRNA材料的需求日益增加。目前多使用化學(xué)合成的方法制備 miRNA,一般僅適用于微量產(chǎn)品的制備,而且價(jià)格極高(每百納摩爾價(jià)格上千元),同時(shí)需要使用大量有毒有害化學(xué)試劑,已成為制約miRNA研究和應(yīng)用的瓶頸問題,尤其無(wú)法滿足miRNA作為攝入功能因子的研究需要,所以急需尋找一種高效、便捷、經(jīng)濟(jì)、可食用的 miRNA制備方法。本研究針對(duì)牙鲆魚中特征miRNA(miR-206),依據(jù)熒光定

3、量PCR作為檢測(cè)手段,采用乙醇沉淀法和膠膜電泳法對(duì)制備可食用級(jí)別miRNA的富集條件進(jìn)行了探索與優(yōu)化。
　　根據(jù)莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測(cè)方法,設(shè)計(jì)兩種miRNA莖環(huán)引物,對(duì)應(yīng)用該方法檢測(cè)本研究中涉及miRNA的靈敏度及檢測(cè)濃度范圍進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,該方法特異性高,經(jīng)過(guò)38個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增反應(yīng)未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增;線性范圍廣,用miRNA濃度與定量PCR反應(yīng)Ct值建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可檢測(cè)10 nM至1 fM濃度的樣品,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線

4、性相關(guān)性良好,R2達(dá)到0.99以上。采用該方法對(duì)牙鲆魚骨骼肌及經(jīng)過(guò)初步處理后所得魚糜水上清中 miR-206定量檢測(cè)結(jié)果顯示,樣品中均含有豐富的miR-206,是miRNA提取富集的理想材料。魚糜水超聲震蕩處理和凍融處理后上清中miRNA含量檢測(cè)比較顯示,震蕩組中miR-206濃度為凍融組的近兩倍,說(shuō)明震蕩處理較凍融更簡(jiǎn)便高效,是一種理想的細(xì)胞破碎釋放miRNA的方式。
　　利用乙醇的沉淀作用,分別對(duì)miRNA水溶液與魚糜水上清進(jìn)

5、行了沉淀處理,分析不同乙醇濃度下魚糜水上清中的miRNA沉淀情況。結(jié)果顯示,使用乙醇沉淀魚糜水上清時(shí),乙醇濃度升高后沉淀中miRNA含量明顯升高,經(jīng)過(guò)濃度為70％的乙醇處理并低速離心后,魚糜水中95%以上miRNA富集到沉淀中。依據(jù)不同濃度乙醇沉淀結(jié)果,選擇濃度分別為10%、30%、50%的乙醇依次對(duì)魚糜水上清進(jìn)行梯度乙醇沉淀,經(jīng)過(guò)逐級(jí)分離,最終將miRNA富集與30%乙醇沉淀中,其miRNA占到了總量的近60%,可作為進(jìn)一步的富集純化

6、的優(yōu)良原料。
　　針對(duì)膠膜電泳法分離富集核酸,首先采用一段82 bp的DNA片段對(duì)膠膜電泳條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化,包括電壓(電場(chǎng)強(qiáng)度)、電泳緩沖液濃度(離子強(qiáng)度)、凝膠膜濃度等。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在相同離子濃度(1×TBE)和膠膜濃度(2%)條件下,150 V電壓下正極區(qū)核酸富集速率是50 V電壓時(shí)的近8倍,電壓越高核酸富集速率越高。緩沖液升溫速率與其承受電壓成正比,150 V時(shí)升溫速率為1 oC/min,100 V時(shí)為0.5 oC/m

7、in,50 V時(shí)僅為0.1 oC/min。相同電壓(100 V)和膠膜濃度(2%)下使用濃度分別為0.5×、1×、1.5×的TBE作為電泳緩沖液實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),離子強(qiáng)度與電泳富集效率有關(guān),0.5×TBE下電泳45 min后正極核酸濃度僅為1.5×TBE時(shí)的60%左右。離子濃度高時(shí)緩沖液升溫明顯,1.5×TBE升溫速率為0.4 oC/min,1.0×和0.5×TBE升溫速率分別為0.2 oC/min和不足0.1 oC/min。凝膠膜濃度實(shí)驗(yàn)表明

8、,濃度為1.5%的凝膠通過(guò)量最大,是2.5%凝膠的近三倍;濃度為1.5%的凝膠在10 min時(shí)即富集出大部分DNA,比另兩組時(shí)間縮短近10 min。采用優(yōu)化后的條件電泳富集282 bp DNA溶液45 min后正極富集區(qū)DNA濃度由0升高至63 ng/μL,將核酸濃度提高至初始樣品的六倍。魚糜水或經(jīng)醇沉處理后的魚糜水沉淀物,繼續(xù)使用膠膜電泳進(jìn)行miRNA富集,在0.5 h內(nèi),即獲得超過(guò)9 fmol的miR-206,其中經(jīng)過(guò)乙醇沉淀和蛋白