CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在中國HIV感染者疾病進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文首次對中國不同疾病進(jìn)展階段HIV感染者“CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞”數(shù)量、與細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的相關(guān)性以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞內(nèi)CTLA-4的作表達(dá)水平進(jìn)行了研究，初步探討了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系。 研究方法： 1．研究對象： 73例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者來自中國遼寧、吉林和河南，其中男性35例，女性38例，年齡分布為30-68歲(40.4±11.0)。根據(jù)HIV感染時間和

2、CD4+T細(xì)胞數(shù)量將上述患者分為HIV感染長期不進(jìn)展組(感染時間>10年，CD4+T細(xì)胞>500個/μl)、典型進(jìn)展HIV組(感染時間>5年，CD4+T細(xì)胞介于200-500個/μl之間，無艾滋病指征性疾病)和典型進(jìn)展AIDS組(感染時間>5年，CD4+T細(xì)胞<200個/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病)。73例HIV/AIDS患者中LTNP組24例、HIV組30例、AIDS組19例。16例健康對照為隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的

3、健康人，其中男性7名，女性9名。 2．CD4<'+>T細(xì)胞絕對值及病毒載量檢測。CD4絕對值依據(jù)1997年美國CDC關(guān)于HIV感染者CD4<'+>T細(xì)胞檢測指導(dǎo)方法，應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀MULTISET軟件檢測。病毒載量采用RT-PCR方法，用美國Roche公司的COBAS AMPLICOR自動載量儀測定病毒載量。 3．CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)

4、胞檢測。密度梯度離心法分離HIV-1感染者及健康人PBMC。Foxp3<'+>細(xì)胞的檢測應(yīng)用PEanti-human Foxp3染色試劑盒，方法如下：向流式管1x10<'6>PBMC中加入anti-CD3-PerCP、anti-CD25-APC、anti-CD4-PE-Cy7，4℃避光染色30分鐘。用PBS洗滌后加入1ml破膜/固定劑，4℃避光染色40分鐘。洗滌后加入2％(2μL)鼠血清，4℃避光15分鐘，加入anti-Foxp3-PE

5、及IgG2a-PE同型對照，4℃避光30分鐘，洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD4-PE-Cy7定義CD4<'+>T細(xì)胞，計算這一細(xì)胞群內(nèi)CD25<'+>Foxp3<'+>細(xì)胞的比率。 4．淋巴細(xì)胞活化及凋亡水平檢測。取HIV-1感染者及健康人全血100μl，應(yīng)用以下熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色：CD8-FITC/CD95-PE/CD3-Pe

6、rCP/CD4-APC-Cy7、HLA-FITC/CD38-PE/CD8-APC/CD4-APC-Cy7，室溫避光染色30min。加入溶血素3毫升，室溫避光10分鐘，1200r/min離心5min，棄上清。加入3ml PBS洗滌兩次，加入1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC定義淋巴細(xì)胞，分析CD4、CD8<'+>T細(xì)胞表面HLA-DR、CD38及CD95表達(dá)水平。 5．CD8

7、<'+>T細(xì)胞絕對值檢測。將20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，經(jīng)反向加樣法加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測并進(jìn)行自動分析，計算CD8+T淋巴細(xì)胞絕對值。 6．NK細(xì)胞絕對值檢測。將20μl CD45FITC/CDl6+56+PE/CD3PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，經(jīng)反向加樣法加入50μ l抗凝血，

8、室溫避光15min，加入免洗溶血素450 μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測并進(jìn)行自動分析，計算NK細(xì)胞絕對值。 7．NK細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞Perforin、Granzyme-B表達(dá)水平檢測。密度梯度離心法分離HIV-1感染者PBMC。向流式管1x10<'6>PBMC中加入anti-CD8-PerCP、anti-CD56APC、anti-CD3-APC-Cy7，4℃避光染色30分鐘。用PBS洗滌后

9、加入1ml破膜/固定劑，4℃避光染色40分鐘。洗滌后加入2％(2μL)鼠血清，4℃避光15分鐘，加入anti-Granzyme-B-FITC、anti-perforin-PE及相應(yīng)同型對照，4℃避光30分鐘，洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC定義淋巴細(xì)胞，CD3-CD56+、CD3+CDS+T淋巴細(xì)胞內(nèi)Perforin、Granzyme-B表達(dá)水平分別乘以NK、CD8+

10、T淋巴細(xì)胞絕對值獲得Perforin、Granzyme-B表達(dá)水平。 8．CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞內(nèi)CTLA-4表達(dá)水平檢測。密度梯度離心法分離HIV-1感染者PBMC。向流式管1x10<'6>PBMC中加入anti-CD3-PerCP、anti-CD25-APC、anti-CD4-PE-Cy7，4℃避光染色30分鐘。用PBS洗滌后加入1ml破膜/固定劑，4℃避光染色40分鐘。洗滌后加入2％(

11、2μL)鼠血清，4℃避光15分鐘，加入anti-Foxp3-FITC、anti-CTLA-4-PE及相應(yīng)同型對照，4℃避光30分鐘，洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD4-PE-Cy7、CD25-APC、Foxp3-FITC定義調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，計算這一細(xì)胞群內(nèi)CTLA-4的表達(dá)百分率。 研究結(jié)果： 1．HIV感染者CD4<'+>CD

12、25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平。通過單細(xì)胞水平檢測外周血PBMC中CD3<'+>CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>T細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，LTNP組、健康對照組、HIV組、AIDS組CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量依次升高，HIV組明顯低于AIDS組(P<0.05)，與健康對照組無顯著性差異。LTNP組CD3<'+>CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>T細(xì)胞水平明顯低于H

13、IV組及AIDS組(P<0.01)，值得注意的是，盡管LTNP組與健康對照組相比CD4+T細(xì)胞數(shù)量并無差異，但CD3<'+>CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>T細(xì)胞水平明顯低于健康對照組(P<0.05)。 2．CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4<'+>T細(xì)胞、病毒載量的相關(guān)性。HIV感染者CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4<'+>T細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)(

14、r=-0.571，P<0.001)，與病毒載量明顯正相關(guān)(r=0.453，P<0.001)。健康人CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4<'+>T細(xì)胞無顯著相關(guān)性。 3．CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與淋巴細(xì)胞活化及凋亡的相關(guān)性。HIV-1感染者CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞凋亡水平呈明顯正相關(guān)(CD4

15、<'+>T細(xì)胞凋亡：r=0.352，P=-0.002；CD8<'+>T細(xì)胞凋亡：r=0.359，P=0.002)，與淋巴細(xì)胞活化水平無顯著相關(guān)性。 研究結(jié)論： 1．LTNP組、健康對照組、HIV組、AIDS組CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量依次升高，與HIV感染疾病進(jìn)展明顯相關(guān)。 2．LTNP組CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平低于HIV組及AID

16、S組，而且明顯低于健康對照組，提示低水平的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量對感染后疾病不進(jìn)展具有保護(hù)作用。 3．中國HIV感染者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞數(shù)量功能的變化密切相關(guān)，提示高水平的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞數(shù)量功能的下降，從而影響疾病進(jìn)程。 4．健康對照組、LTNP組、HIV組、AIDS組CD4<'+>CD25<'+>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞內(nèi)CTLA-4表達(dá)水平依次升高，且與CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)量顯著負(fù)相