基于鎖式探針的豆類四種重要植物病原細(xì)菌快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、隨著我國(guó)豆類種子進(jìn)口量的飛速增長(zhǎng)，種子攜帶檢疫性細(xì)菌風(fēng)險(xiǎn)日益加大，嚴(yán)重影響我國(guó)豆類產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)。本研究擬以豌豆細(xì)菌性疫病菌、菜豆暈疫病菌、菜豆普通細(xì)菌性疫病菌和菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌等4種重要植物原細(xì)菌作為靶標(biāo)菌，首次集成創(chuàng)新利用瑣式探針和液相懸浮芯片兩項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，研究搭建豆類重要植物病原細(xì)菌快速高通量核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，以替代過(guò)去對(duì)單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行逐一檢測(cè)的傳統(tǒng)方法，大幅提高檢測(cè)效率，解決我國(guó)豆類種子進(jìn)境過(guò)程種攜帶的外來(lái)有害生物入侵風(fēng)險(xiǎn)管理和預(yù)

2、防控制，以及快速通關(guān)等難題。本研究主要成果如下:
　　1)首次設(shè)計(jì)了豌豆細(xì)菌性疫病菌、菜豆暈疫病菌、菜豆普通細(xì)菌性疫病菌和菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌等4種重要病原細(xì)菌的鎖式探針，通過(guò)優(yōu)化連接反應(yīng)、消化反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)體系條件，構(gòu)建了基于鎖式探針的豌豆細(xì)菌性疫病菌、菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌和菜豆疫暈病菌等4種單重滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)體系，并評(píng)估其特異性和靈敏度。結(jié)果表明:4種單重滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法能夠分別特異地檢測(cè)對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)菌，而其他陰性對(duì)照菌株均無(wú)法檢

3、出，有較高的特異性;其中豌豆細(xì)菌性疫病菌、菜豆暈疫病菌和菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌單重滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)靈敏度與常規(guī)PCR靈敏度持平,分別為600 fg/μL、600fg/μL和4.34pg/μL;而菜豆普通細(xì)菌性疫病菌單重滾環(huán)擴(kuò)增靈敏度為38.3fg/μL，比常規(guī)PCR靈敏度高出1個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　2)首次建立了豌豆細(xì)菌性疫病菌、菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌、菜豆疫暈病菌和菜豆普通細(xì)菌性疫病菌等4重滾環(huán)擴(kuò)增方法并結(jié)合液相懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)

4、體系中同時(shí)、快速檢測(cè)出4種細(xì)菌，評(píng)估其檢測(cè)體系的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。結(jié)果表明:該檢測(cè)體系能夠同時(shí)特異地檢測(cè)到4種或其中某幾種靶標(biāo)菌，檢測(cè)豌豆細(xì)菌性疫病菌的DNA和菌懸液靈敏度分別為4.85pg/μL和1.6×104cfu/ml，檢測(cè)菜豆疫暈病菌的DNA和菌懸液靈敏度分別為874 fg/μL和1.5×103cfu/ml，檢測(cè)菜豆普通細(xì)菌性疫病菌DNA和菌懸液靈敏度分別為486fg/μ L和2.3×103cfu/ml，檢測(cè)菜豆細(xì)菌性萎蔫

5、病菌的DNA和菌懸液靈敏度分別為1.06pg/μL和1.1×104cfu/ml;組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于7.2％，具有良好的重復(fù)性。
　　3)通過(guò)系列梯度濃度的純菌懸液混合健康種子浸泡液檢測(cè)試驗(yàn)中，常規(guī)PCR僅能檢測(cè)到100倍菌懸液處理液的菜豆普通細(xì)菌性疫病菌，而其他稀釋倍數(shù)的處理以及其他靶標(biāo)菌的處理液均無(wú)法被檢測(cè)出;而四重液相檢測(cè)可以在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)同時(shí)檢出100、101倍菌懸液處理液中的豌豆細(xì)菌性疫病菌、菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌、菜豆疫