松落針病病原的快速分子檢測技術(shù)研究.pdf

1、松落針病是一種松樹上嚴(yán)重的葉部病害，自1927年朱美鳳首次報導(dǎo)馬尾松上由松針散斑殼(Lophodermium pinastri)引起的落針病以來，眾多學(xué)者普遍認(rèn)為松針散斑殼（L.p)即松落針病的病原。本研究以二郎山松樹上的松針散斑殼(L.p）為研究對象，通過擴增病原菌核糖體ITS(internal transcribed spacer)基因區(qū)段，設(shè)計特異性引物，在落針病表現(xiàn)癥狀引起危害前，采用常規(guī)PCR方法擴增病原菌將其檢測出，為后續(xù)防

2、治工作提供依據(jù)。
　　 試驗前期于2008年7-8月在四川瀘定二郎山林場人工松林采集已經(jīng)發(fā)病的松針，采用子囊果組織分離法，分得松針散斑殼(L.p)作為供試菌株，并擴增其ITS區(qū)域，經(jīng)NCBI比對確認(rèn)后，以此序列為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計特異引物。
　　 共設(shè)計特異性引物24對，篩選出最優(yōu)引物一條，編號5-3，序列為：
　　 F(5’-3’):5-AAGAATACAGGCTTCACG-318bp
　　 R(5’-3’)：5

3、-GGTCAACCTTGTATGGTG-318bp
　　 本試驗共比較7種總DNA提取方法，包括核沉淀法、改良核沉淀法、二次沉淀法、CTAB法、高鹽低pH法、氯化芐法、尿素提取法，發(fā)現(xiàn)核沉淀法和改良核沉淀法提取總DNA后的擴增效果最佳。同時優(yōu)化了檢測體系的PCR反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)引物的最佳退火溫度應(yīng)在50℃-54℃，引物濃度0.2μL(10mM)，模板DNAlpL(約20-30ng)為反應(yīng)的最佳濃度。
　　 在檢測過程中于2

4、009年3月之前都沒能檢測到松針散斑殼（L.p)存在，自2009年3月（包括3月）之后就能明顯的檢測到，但是只在松針的尖部和中部檢測到了松針散斑殼(L.p)，在基部沒有發(fā)現(xiàn)。將每月經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后的PCR產(chǎn)物(48個)和瓊脂糖膠回收產(chǎn)物(27個)送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對均為松針散斑殼(L.p)。
　　 試驗結(jié)果表明利用病原菌的ITS區(qū)設(shè)計特異引物，用PCR的方法來檢測尚處于潛伏期的松針散斑

5、殼(L.p)行之有效，因為ITS區(qū)在種內(nèi)不同菌株間高度保守而且存在著豐富的變化，足以針對某一種真菌設(shè)計特異引物，且由于特異性高，松樹和其他真菌的DNA不會隨著一起擴增，很容易在松樹發(fā)病前將其檢測出來。針對松針散斑殼（L.p)，用本試驗方法在松樹發(fā)病前約兩個月的時候，特別是在松針看起來正常，剛出現(xiàn)褐色小斑點的時就能將其檢測出來，此時若集中燒毀松林內(nèi)落地病針以減少初侵染源，并加強水肥管理輔以施用殺菌劑如石硫合劑、多菌靈等，便能很好的阻止松針