幾種桉樹焦枯病原菌的快速分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、桉樹(Eucalyptus spp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉樹屬(Eucalyptus)植物的總稱，同時(shí)是世界著名的用材林樹種和速生樹種，與楊樹、松樹并稱為林業(yè)上的三大速生造林樹種。桉樹在我國西南、東南、長江中下游等地區(qū)的生態(tài)環(huán)境建設(shè)以及解決生物能源問題中發(fā)揮著不可替代的作用，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、生態(tài)效益。目前在我國西南地區(qū)由半知菌亞門的帚梗柱孢屬真菌(Cylindrocladium scoparium)引起的桉樹焦枯病嚴(yán)

2、重危害著桉樹的林業(yè)生產(chǎn)建設(shè)。由于該病害發(fā)病癥狀極易與其他桉樹葉部病害混淆，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定存在困難，因此建立能夠在病害發(fā)生早期快速診斷病害的分子生物學(xué)診斷方法迫在眉睫。本研究選定不同的靶基因序列，分別建立了基于ITS與factor1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR檢測(cè)體系、巢式PCR體系、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系（LAMP）三種分子生物學(xué)診斷技術(shù)，以期為桉樹焦枯病的林業(yè)生產(chǎn)建設(shè)提供有力的技術(shù)保障。本研究取得如下結(jié)果:
　　1.

3、成功構(gòu)建了基于ITS與factor1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR檢測(cè)體系。該體系以桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)DNA為模版，分別以ITS和factor1-alpha序列為靶區(qū)域，針對(duì)Cylindrocladium屬和Cylindrocladium scoparium設(shè)計(jì)了CYS1/CYS2和EF-S-1/EF-A-1兩對(duì)特異性引物，建立了基于屬和種的雙重PCR快速檢測(cè)技術(shù)。利用引物BC

4、YS1/CYS2可以將全部Calonectria屬的供試菌株擴(kuò)增出一條351 bp大小的條帶，單獨(dú)用特異性引物EF-S-1/EF-A-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增僅病原菌擴(kuò)增出一條197bp大小的條帶，同時(shí)使用2對(duì)引物時(shí)，病原菌可擴(kuò)增出兩條明亮條帶。當(dāng)體系退火溫度為53℃時(shí)，DNA靈敏度檢測(cè)限度達(dá)到450 fg/μL。野外田間時(shí)效檢測(cè)結(jié)果顯示，該體系能準(zhǔn)確檢測(cè)出不同發(fā)病程度桉樹組織上的病原菌，完全符合田間檢測(cè)的要求。
　　2.針對(duì)Cylind

5、rocladium scoparium菌株的beta-tubulin gene上保守序列極強(qiáng)的靶基因區(qū)域序列進(jìn)行特異性引物BT-S-1/BT-A-1和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的設(shè)計(jì)和合成，分別利用常規(guī)PCR和巢式PCR技術(shù)對(duì)引物特異性和靈敏度進(jìn)行檢測(cè)和比較，同時(shí)對(duì)所建立的巢式PCR用于桉樹焦枯病原菌快速檢測(cè)的田間時(shí)效性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，利用beta-tubulin gene序列通用引物BT-T1-S/BT-C

6、YLTUBIR對(duì)全部供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增，所有參試菌株均可擴(kuò)增出一條500 bp左右大小的條帶;而單獨(dú)使用特異性引物BT-S-1/BT-A-1進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)僅病原菌能夠擴(kuò)增出一條大小為148 bp的明亮條帶;當(dāng)利用通用引物作為第一輪引物，以稀釋10倍后的第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR模板，利用特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增時(shí)，也可擴(kuò)增出上述148bp大小的明亮條帶，且巢式PCR的擴(kuò)增效果較常規(guī)PCR具有明顯的視覺優(yōu)越性;靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)

7、表明，巢式PCR的靈敏度可檢測(cè)到4.5 fg/μL，較常規(guī)PCR可以擴(kuò)增出的極限D(zhuǎn)NA濃度4.5 pg/μL至少提高了103倍;田間時(shí)效檢測(cè)試驗(yàn)也說明巢式PCR較常規(guī)PCR具有更高的準(zhǔn)確度和靈敏性，可達(dá)到田間檢測(cè)的要求。
　　3.建立了桉樹焦枯病快速有效的LAMP快速檢測(cè)技術(shù)。本試驗(yàn)以桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium為研究對(duì)象，利用Primer Explorer V4.0設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)C.scopa

8、rium的beta-tubulin gene特異保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一套LAMP特異性引物組（內(nèi)引物FIP/BIP，外引物F3/B3，環(huán)引物L(fēng)ooPF/LooPB），優(yōu)化并建立了桉樹焦枯病原菌的LAMP快速檢測(cè)體系。研究得到，LAMP反應(yīng)體系為(50μl):8 U Bst DNAPolymerase1μl;5 M甜菜堿溶液3.0μl;2.5 mM dNTP3.5μl;10×ThermopolⅡ2.5μl;100 mM MgCl2μl;40μM

9、 FIP/BIP各1μl;10μM F3/B3各0.5μl;10μMLooPF/LooPB各1μl; DNA模板2μl;用ddH2O補(bǔ)足體積至50μl。反應(yīng)程序?yàn)?65℃水浴鍋中反應(yīng)45 min，90℃下滅活5 min結(jié)束反應(yīng)。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，供試的22個(gè)樣本菌株LAMP產(chǎn)物可以采用肉眼觀察、紫外燈照射、添加熒光染料SYBR GreenⅠ、以及電泳檢測(cè)條帶四種不同的形式予以區(qū)分。DNA靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的LAMP體系具有較高檢

10、測(cè)靈敏度，可達(dá)到45 pg/μL，完全符合田間檢測(cè)的要求。野外田間時(shí)效檢測(cè)結(jié)果顯示，無論是利用紫外檢測(cè)還是電泳檢測(cè)均可成功的檢測(cè)出各地區(qū)不同生理小種的桉樹焦枯病原菌C.scoparium，且檢測(cè)效果明顯。該LAMP檢測(cè)是一項(xiàng)能夠作為野外基層田間檢測(cè)的重要技術(shù)。
　　總之，本研究針對(duì)桉樹焦枯病病原菌C.scoparium所建立的三種分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)均可有效用于桉樹焦枯病害的早期診斷。巢式PCR體系具有高于其他兩種檢測(cè)方法的較高