正己烷中毒性神經(jīng)病細胞骨架變性及其機制研究.pdf

1、研究目的: 正己烷（n-hexane）是一種常用的工業(yè)溶劑，主要應用于粘膠配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制藥、家具制造及電子元件制造等行業(yè)。由于正己烷的急性毒性較低，而使人們忽視了長期慢性低濃度接觸正己烷可導致以感覺運動型多發(fā)性周圍神經(jīng)病為主要臨床特征的慢性中毒。 正己烷中毒患者早期表現(xiàn)為手足發(fā)麻、刺痛、蟻走感、手足部痛覺、觸覺減退呈手套、襪套樣分布等，進一步發(fā)展可表現(xiàn)為四肢無力、行走困難以至不能站立甚

2、至出現(xiàn)下肢癱瘓及肌肉萎縮。神經(jīng)病理檢查發(fā)現(xiàn)損傷最初發(fā)生在遠端最長、最粗的感覺和運動神經(jīng)軸索，并且在郎飛氏節(jié)附近形成巨大的充滿神經(jīng)絲（neurofilament，NFs）的腫脹，郎飛氏節(jié)解剖結構扭曲且髓鞘從腫脹處回縮，有時伴有節(jié)段性脫髓鞘，最后一些遠離神經(jīng)腫脹部位的軸索發(fā)生變性。盡管許多工作致力于正己烷中毒性神經(jīng)病的研究，但其發(fā)病機制尚不清楚?；谡和橹卸镜某⒔Y構觀察和組織病理學改變，為進一步探討正己烷中毒性神經(jīng)病發(fā)生的分子機制，我們

3、建立了正己烷終毒物2，5-己二酮（2，5-hexanedione，HD）亞慢性中毒大鼠模型，以細胞骨架蛋白為切入點，觀察中毒性神經(jīng)病發(fā)生過程中NFs、微管（α-tubulin、β-tubulin）和微絲（β-actin）蛋白相對含量的變化，確定作用靶點，并在此基礎上從細胞骨架蛋白降解的角度進一步探討細胞骨架蛋白變化的原因，包括磷酸化及其相應蛋白激酶信號通路的變化、泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，

4、UPS）的改變等等，為正己烷職業(yè)中毒的預防和治療提供可以借鑒的基礎資料。同時，探討血清中各骨架蛋白含量的變化評價正己烷接觸的效應標志物以檢測和評價神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可行性，為正己烷等毒物神經(jīng)毒性的臨床監(jiān)測提供實驗依據(jù)。 研究方法: 1．雄性Wistar大鼠用200和400 mg/kg．bw的HD腹腔注射染毒，染毒時間8周（每周染毒5d，每日1次），建立正己烷中毒性周圍神經(jīng)病模型。 2．取大鼠大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織在

5、勻漿緩沖液（1％Triton X-100，50 mM Tris（pH7．5），25 mM KC1，2 mM MgCl2，5 mM EGTA，5 mM dithiothreitol，ProteaseInhibitor Cocktail（50ul/g tissue）and phosphatase inhibitors（5 mM Na3VO4，10mM Na4P2O7 and1 mM iodoacctic acid）中制備勻漿，100，000

6、×g、4℃離心60 min。采用Western-Blotting技術研究大鼠大腦、脊髓、坐骨神經(jīng)上清和沉淀以及血清中phos-NF-H（pNF-H）、phos-&n-phos-NF-H（p&n-pNF-H）、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin等骨架蛋白。 3．神經(jīng)組織通過勻漿緩沖液A（20 mM Tris-HCL buffer（PH7．4），1 mM DTT，5mM EGTA，2 mM E

7、DTA，10％glycerol，1 mM MgCl2，1 mM PMSF，2μg/mlaprotinin，and2μg/ml leupeptin）和B（100 mM KC1，5 mM NaCl，3 mM MgCl2，50 mM Hepes，pH7．4，1 mM dithiothreitol（DTT），0．5μg/ml aprotinin，0．5μg/mlleupeptin，200μM PMSF and1 mM EGTA）制備組織勻漿，然

8、后27，000×g、4℃離心60 min提取神經(jīng)組織胞膜和胞漿蛋白組分，分別測定鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/CaM-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、周期蛋白依賴性的蛋白激酶5（cyclin dependent kinase5，CDK5）和CDK

9、5相關因子含量的變化。 4．取大鼠大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織胞膜和/或胞漿蛋白組分，利用放射性同位素技術研究HD染毒對大鼠神經(jīng)組織中CaMKⅡ、PKA、PKC和CDK5活性的影響。 5．真核表達Flag-NFM質(zhì)粒的構建、轉(zhuǎn)化、鑒定、擴增和提純。 6．培養(yǎng)HEK293細胞，將不同質(zhì)粒按不同目的需要組合，利用細胞轉(zhuǎn)染技術轉(zhuǎn)染HEK293細胞，采用免疫共沉淀和Western-blotting等技術檢測HD染毒情況下NF

10、s與E3連接酶的結合、泛素化以及被蛋白酶體降解情況。 7．神經(jīng)組織在相應勻漿液（50 mM Tris HC1，pH7．4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1％Triton X-100 and1％Protease Inhibitor Cocktail）中8200×g、4℃離心30min，取上清，測定UPS系統(tǒng)中各組分E1、E3泛素連接酶和蛋白酶體的含量和活性。 結論: 1．NFs比微管和微絲更加敏感，易

11、受HD損傷，可能是正己烷中毒性神經(jīng)病的分子靶點。 2．pNF-H含量在HD中毒大鼠血清中明顯升高，并與大鼠神經(jīng)行為異常呈明顯的相關性，表明pNF-H可作為HD中毒性神經(jīng)病早期診斷的生物標志物。 3．HD中毒導致大鼠神經(jīng)組織CaM、PKA、PKC和CDK5的含量和活性以及NFs聚合率的變化，表明NFs相關蛋白信號通路和NFs磷酸化狀態(tài)改變可能參與了HD中毒性神經(jīng)病的發(fā)生。 4．由于CaMKII在脊髓和坐骨神經(jīng)組織中

12、為檢測到，說明Ca2+-CaM-CaMKII-NFs磷酸化信號通路可能部分地參與了HD中毒性神經(jīng)病發(fā)生。 5．PKA、PKC和CDK5活性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)能夠變化不一致，可能決定了NFs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)通過不同的途徑降解。 6．CHIP作為一種含U-box結構域的E3連接酶促進NFs泛素化并通過蛋白酶體降解。 7．蛋白酶體抑制劑MG132部分地抑制了HD促進NFs降解，說明UPS通路在HD