吡咯加合物作為慢性正己烷中毒早期神經(jīng)損傷的生物標(biāo)志物研究.pdf

1、研究目的:
　　正己烷（n-hexane）是一種常用的工業(yè)溶劑，主要應(yīng)用于粘膠配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制藥、家具制造及電子元件制造等行業(yè)。正己烷的急性毒性較低，但長(zhǎng)期慢性低濃度接觸可導(dǎo)致以感覺(jué)運(yùn)動(dòng)型多發(fā)性周?chē)窠?jīng)病為主要臨床特征的慢性中毒。
　　目前關(guān)于正己烷的生物標(biāo)志物的研究比較多，例如:2，5-己二酮、血影蛋白、神經(jīng)骨架蛋白、髓鞘堿性蛋白、神經(jīng)元特異烯醇化酶、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等指標(biāo)，但是，這些指標(biāo)都存

2、在一定的缺陷。并不是正己烷最理想的生物標(biāo)志物。正己烷可在體內(nèi)代謝為2，5-己二酮(2，5-HD)，2，5-HD與氨基殘基可形成吡咯加合物。本研究以吡咯加合物為切入點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定吡咯加合物能否成為正己烷的生物標(biāo)志物？并確定其生物接觸限值。
　　研究方法:
　　1.方法建立。通過(guò)埃利希試劑建立吡咯加合物的測(cè)定方法;通過(guò)氣相色譜儀建立2，5-HD的測(cè)定方法;
　　2.離體研究。取大鼠的血清以及其他組織加入2，5-HD后

3、，放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究在各種條件下吡咯加合物的生成情況，以及影響吡咯加合物生成的因素;
　　3.毒代動(dòng)力學(xué)研究。4組大鼠，其中2組大鼠，腹腔注射2，5-HD一次，劑量分別為200，400mg/kg，在染毒后1，2，4，8，24，48，72，96和120h，經(jīng)過(guò)眼內(nèi)眥取血和壓痛取尿。另外2組大鼠，腹腔注射2，5-HD每天一次，連續(xù)5天，劑量分別為200，400mg/kg，在末次染毒后1，2，4，8，24，48，72，

4、96，144，192，240，288，336，384h經(jīng)過(guò)眼內(nèi)呲取血和壓痛取尿，進(jìn)行尿和血清中吡咯加合物的測(cè)定。
　　4.吡咯加合物組織分布與2，5-HD相關(guān)性研究。4組大鼠，分別給與500，1000，2000，4000mg/kg劑量的正己烷，連續(xù)5天染毒后，在第5次染毒后24h時(shí)刻處死大鼠，取血清、尿、肝、腎、大腦、脊髓等組織，對(duì)組織中的2，5-HD和吡咯加合物的濃度進(jìn)行了測(cè)定，研究了2，5-HD和吡咯加合物的組織分布，以及在不

5、同的組織中2，5-HD和吡咯加合物的相關(guān)性。
　　5.吡咯加合物作為正己烷神經(jīng)損傷生物標(biāo)志物。6組大鼠，5組分別給與500，1000，1500，2000，4000mg/kg劑量的正己烷，1組對(duì)照給與等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)24周，每周一次經(jīng)過(guò)眼內(nèi)呲取血和壓痛取尿，時(shí)間為染毒后8h和24h，同時(shí)對(duì)大鼠的步態(tài)行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。分析吡咯加合物與神經(jīng)損傷的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果:
　　1、2,5-HD和吡咯加合物測(cè)定

6、方法
　　吡咯加合物測(cè)定方法:取一定量的血清、尿、肝、腎等生物組織樣品，加入生理鹽水勻漿，取勻漿液加入鹽酸胍消化，8000g離心后，取上清液加入埃利希試劑顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀526nm進(jìn)行測(cè)定。
　　2，5-HD的測(cè)定方法:取一定量的血清、尿、肝、腎等生物組織樣品，加入生理鹽水勻漿，勻漿液中加入無(wú)水碳酸鉀和鹽酸胍，加入內(nèi)標(biāo)物（環(huán)己酮），加入二氯甲烷萃取后離心，取萃取液進(jìn)氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。若萃取液中2，5-HD濃度較低的樣品，可

7、使用氮?dú)獯祾?，將萃取液濃縮后，進(jìn)行測(cè)定。
　　2、吡咯加合物體外實(shí)驗(yàn)
　　吡咯加合物的生成量與2，5-HD、組織的濃度具有劑量效應(yīng)關(guān)系;吡咯加合物的生成速率與環(huán)境溫度呈現(xiàn)正相關(guān);在大腦、脊髓組織中吡咯加合物生成速度最快;人血清和大鼠血清吡咯加合物生成的速率不一樣，吡咯加合物在人血清中的生成速率約為鼠血清的3倍;2，5-HD向吡咯加合物的轉(zhuǎn)化過(guò)程并不是單方向的反應(yīng)，而是一個(gè)動(dòng)態(tài)的反應(yīng)，當(dāng)吡咯加合物達(dá)到濃度后，形成吡咯加合物的反

8、應(yīng)速度越來(lái)越低，最終，2，5-HD和吡咯加合物的濃度之間達(dá)到一種平衡。
　　3、2，5-HD和吡咯加合物的毒代動(dòng)力學(xué)
　　吡咯加合物在血清中呈現(xiàn)一個(gè)時(shí)間蓄積的變化趨勢(shì)，但是尿中的吡咯加合物、尿中2，5-HD、血清中2，5-HD保持一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值，無(wú)蓄積趨勢(shì)出現(xiàn)。血清中2，5-HD和吡咯加合物的半衰期分別為2.27±0.28h和25.3±3.34h。尿中吡咯加合物與血清(r=0.736，P＜0.001)和尿(r=0.730，P

9、＜0.001)中2，5-HD的呈現(xiàn)相關(guān)性，血清中吡咯加合物與2，5-HD的累積暴露量呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性（r=0.965，P＜0.001)。
　　4、2，5-HD和吡咯加合物組織分布以及相關(guān)性
　　組織中的2，5-HD和吡咯加合物與正己烷的染毒劑量呈現(xiàn)劑量效應(yīng)反應(yīng)關(guān)系。2，5-HD在尿中含量最高，坐骨神經(jīng)中含量最低，但是，吡咯加合物在肝臟中的含量最高，血清中的含量最低。在同一組織中，游離2，5-HD、總2，5-HD和吡咯加合物具

10、有顯著的相關(guān)性，在不同的組織中，血清中的吡咯加合物與組織中游離的2，5-HD和吡咯加合物的相關(guān)性最強(qiáng)。
　　5、吡咯加合物最大無(wú)作用劑量（NOAEL）的確定
　　尿和血清中吡咯加合物與正己烷的染毒劑量有明顯的劑量效應(yīng)反應(yīng)關(guān)系，尿和血清中的吡咯加合物的濃度在染毒后4周達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期。尿和血清中吡咯加合物的濃度與達(dá)到癱瘓時(shí)間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但是尿和血清中吡咯加合物的濃度與神經(jīng)損傷的步態(tài)評(píng)分指標(biāo)成正相關(guān)。大鼠吡咯加合物的NOAEL為染

11、毒后8h，尿和血清的接觸限值為84.6±12.1nmol/ml和7.7±1.97nmol/ml，在染毒后24h，尿和血清的接觸限值為18.2±5.14和3.9±0.88nmol/ml。體外實(shí)驗(yàn)中，人血清中吡咯加合物的生成速度為大鼠血清中的3倍，因此，人體的接觸限值為染毒后8h，尿和血清的接觸限值為253.8±36.3nmol/ml和23.1±5.91nmol/ml，吡咯加合物在染毒后24h，尿和血清的接觸限值為54.6±15.42nmo

12、l/ml和11.7±2.64nmol/ml。
　　結(jié)論:
　　1.吡咯加合物的生成不僅僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的單向的化學(xué)反應(yīng)，受到氨基酸濃度、2，5-HD、溫度等因素的影響。
　　2.吡咯加合物比2，5-HD半衰期長(zhǎng)，并在血清中呈現(xiàn)蓄積效應(yīng)，說(shuō)明血清中的吡咯加合物可能適合作為正己烷的生物標(biāo)志物。
　　3.組織中吡咯加合物與2，5-HD有明顯的相關(guān)性，且血清中的吡咯加合物與組織中的2，5-HD和吡咯加合物的相關(guān)最強(qiáng)，說(shuō)明血清