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文檔簡介
1、目的;為闡明凋亡在丙烯酰胺引起的中毒性神經(jīng)病中的作用,我們建立了大鼠丙烯酰胺亞慢性中毒模型,通過測定大鼠染毒后中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織中bcl-2、bax和caspase-3表達的變化以及核DNA的改變,探討凋亡相關(guān)的分子調(diào)控機制在丙烯酰胺毒性機制中的作用,為研究丙烯酰胺誘導(dǎo)的中毒性神經(jīng)病的發(fā)病機制提供依據(jù)。 方法; 1.建立動物模型選用雄性成年Wistar大鼠分別以20mg/kg體重和40mg/kg體重劑量腹腔注射染毒,
2、每周3次,連續(xù)2個月。 2.神經(jīng)行為指標測定密切觀察各組大鼠一般狀況的變化,每周測量大鼠體重、熱覺傳導(dǎo)、壓痛閾值、后肢撐力、轉(zhuǎn)棒等指標。 3.神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)檢測 1)形態(tài)學檢測通過對大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓石蠟切片的HE染色,觀察是否存在細胞凋亡或/和壞死的形態(tài)學變化。 2)TUNEL法檢測通過對大鼠大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓石蠟切片的TUNEL檢測,確定是否存在核DNA的裂解和細胞凋亡的形態(tài)學改變。
3、 3)凋亡相關(guān)蛋白和酶的檢測通過免疫組織化學方法測定大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓石蠟切片中Bcl-2和Bax免疫活性的變化;通過Westernblotting測定大腦皮質(zhì)、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)中bcl-2、bax和caspase-3表達的變化。 4)DNALadder的檢測測定大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳是否存在DNALadder,來確定是否存在特征性的180~200bp的DNA裂解片段。 結(jié)果 1
4、.體重與神經(jīng)功能測試結(jié)果顯示:與對照組相比,中毒后大鼠體重減輕。神經(jīng)行為學測定結(jié)果表明,大鼠熱覺傳導(dǎo)異常(高劑量組時間延長55%,低劑量組縮短39%),壓痛閾值變小(第3周高劑量組降低45%,第7周低劑量組降低45%),后肢展開距離明顯加寬(高劑量組增加109%,低劑量組增加59%),在轉(zhuǎn)棒上停留的時間縮短(高劑量組縮短98%,低劑量組縮短81%),都有顯著性差異(P<0.05)。 2.HE染色結(jié)果顯示: 1)大腦皮質(zhì):
5、丙烯酰胺染毒組的組織切片并不見細胞數(shù)目的減少和細胞壞死的形態(tài)學改變,也無明顯的凋亡,但低劑量組可見核染色質(zhì)致密濃縮,高劑量組濃縮核進一步增多。 2)小腦:與對照組相比,染毒組小腦切片上浦肯野細胞明顯減少。 3)脊髓腰膨大:正常對照組和染毒組并沒有明顯差異。 3.免疫組化結(jié)果顯示: 1)大腦皮質(zhì):Bcl-2和Bax的陽性反應(yīng)物定位在細胞漿,均勻分布,胞核不著色。圖像分析結(jié)果表明,與正常對照組相比,陽性細胞B
6、cl-2免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度低劑量組降低了14%,高劑量組升高了20%,有顯著性差異(P<0.05);染毒組Bax免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度與對照組相比均無顯著性差異。 2)小腦皮質(zhì):Bcl-2和Bax蛋白在浦肯野細胞和分子層神經(jīng)細胞中的染色強度明顯大于顆粒層細胞。圖像分析結(jié)果表明:與對照組相比,陽性細胞Bcl-2免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度低劑量組降低了22%,高劑量組升高了62%,均有顯著性差異(P<0.01);Bax免疫反應(yīng)
7、產(chǎn)物的積分光度與對照組相比,低劑量升高了22%(P<0.05),高劑量組降低了30%(P<0.01)。 3)脊髓腰膨大:圖像分析結(jié)果表明:與正常對照組相比,陽性細胞Bcl-2免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度在低劑量組降低了20%,高劑量組升高了12%,均有顯著性差異(P<0.05);Bax免疫反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度與對照組相比,兩組均無顯著性差異。 4.Westernblotting分析結(jié)果顯示: 1)大腦皮質(zhì):光密度分析
8、結(jié)果表明,bcl-2的表達在低劑量組降低了22%,高劑量組升高了26%,與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05);bax和caspase-3在低、高劑量組的表達與對照組相比無顯著性差異。 2)小腦:與對照組相比,bcl-2的表達在低劑量組降低了25%,高劑量組升高了13%,均有顯著性差異(P<0.05);bax的表達在低劑量組升高了14%,高劑量組降低了17%,與對照組相比有顯著性差異(P<0.05);染毒組caspase-3
9、的表達與對照組相比均無顯著性差異。 3)脊髓:bcl-2的表達與對照組相比均有顯著性差異,低劑量組降低了33%(P<0.01),高劑量組升高了25%(P<0.05);染毒后bax的表達與對照組相比無顯著性差異;caspase-3在低劑量組的表達增加了41%,高劑量組增加了132%,與對照組相比均有顯著性差異(P<0.01)。 4)坐骨神經(jīng):與對照組相比,bcl-2的表達在低劑量組增加了104%,高劑量組增加了196%,均
10、有顯著性差異(P<0.01);bax的表達在低劑量組增加了49%,高劑量組增加了94%,與對照組相比有顯著性差異(P<0.01);caspase-3的表達低劑量組增加了8%,高劑量組升高了66%,高劑量組與對照組相比有顯著性差異(P<0.01)。 5.TUNEL檢測結(jié)果顯示:光鏡下可見,DNaseⅠ降解處理后陽性對照的大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)和脊髓中的細胞核呈圓形和不規(guī)則形,棕染,著色深,細胞界限不清。實驗組和陰性對照組切片上細胞核均
11、無著色,表明丙烯酰胺染毒后神經(jīng)元幾乎沒有DNA的斷裂,沒有3'-OH形成。 6.DNA瓊脂糖電泳結(jié)果顯示:大腦皮質(zhì)、小腦的對照組和脊髓的三個實驗組只出現(xiàn)一條距加樣孔很近的大分子條帶;小腦低劑量染毒組核DNA電泳后可觀察到不典型的DNALadder,高劑量組則可見涂片狀的DNA電泳結(jié)果,并可見不明顯的梯狀;染毒組大腦皮質(zhì)核DNA電泳呈彌散的片狀圖譜,表明丙烯酰胺可引起大腦皮質(zhì)和小腦神經(jīng)細胞DNA的損傷。 結(jié)論 1.
12、丙烯酰胺亞慢性染毒可引起: 1)大鼠的熱覺傳導(dǎo)異常,痛覺傳導(dǎo)加快,運動神經(jīng)損傷,運動協(xié)調(diào)能力降低。 2)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞核發(fā)生致密濃縮性改變,小腦浦肯野細胞丟失。 3)大腦皮質(zhì)、小腦和脊髓Bcl-2/Bax改變,低劑量組降低,高劑量組升高。 4)脊髓和坐骨神經(jīng)中caspase-3表達增加。 5)坐骨神經(jīng)中bcl-2和bax的表達增加。 6)中樞神經(jīng)細胞不存在凋亡引起的DNA裂解。
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