經(jīng)宮頸的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用于孕早期產(chǎn)前診斷的初步探討.pdf

1、迄今為止，孕早期獲得胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法大體上分為兩類：創(chuàng)傷性及非創(chuàng)傷性技術(shù)。創(chuàng)傷性的產(chǎn)前診斷方法主要有羊膜腔穿刺法(amniocentesis，AC)及胎兒絨毛取樣法(chorionicvilloussampling，CVS)，這兩種方法都可能對胎兒造成一定的危害，甚至流產(chǎn)。因此，近十幾年來，無創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性孕早期的產(chǎn)前診斷越來越受到廣泛的關(guān)注。1971年，Settles首次在孕早期的宮頸粘液中找到蛻化脫落的胎兒絨毛細(xì)胞，成功地

2、進(jìn)行了性別的診斷。這種利用經(jīng)宮頸獲取胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞(tanscervicalcollection，TCC)，有可能成為一種新的、具有臨床應(yīng)用價值的孕早期性連鎖及染色體異常遺傳病的產(chǎn)前診斷方法。由于取材方法和檢測技術(shù)的不同，使胎兒細(xì)胞的檢出率有很大差別，對最佳的取材部位及取材時間結(jié)論也不盡相同。因此本課題旨在對經(jīng)宮頸獲取的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用于孕早期性連鎖遺傳病產(chǎn)前診斷的可行性進(jìn)行研究，并對其方法學(xué)以及某些影響因素作初步的探討。 第一部

3、分孕早期經(jīng)宮頸獲取胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷的可行性研究 目的：探討經(jīng)宮頸獲取胎兒細(xì)胞應(yīng)用于孕早期產(chǎn)前診斷的可行性。 方法：收集孕6.10周行人工流產(chǎn)手術(shù)婦女的經(jīng)宮頸沖洗液，所有樣本分為兩份。一份行蘇木精伊紅染色和CK7的細(xì)胞免疫化學(xué)染色，觀察胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞獲取率；另一份抽提DNA，對X染色體的凝血因子Ⅷ和Y染色體的SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增。人流后的絨毛采用直接法分析染色體核型確定流產(chǎn)胎兒性別，并與PCR結(jié)果相比較。 結(jié)果

4、：20份經(jīng)宮頸沖洗的樣本中，用蘇木精伊紅常規(guī)染色和CK7的細(xì)胞免疫化學(xué)染色，只有4例檢測出胎兒的滋養(yǎng)細(xì)胞，僅占20﹪；利用PCR檢測出7／12名(58．3﹪)男胎的SRY基因，而8名女胎的SRY基因均未檢測出。 結(jié)論：孕早期經(jīng)頸管能獲取到胎兒的滋養(yǎng)細(xì)胞，可以為性別連鎖及單基因遺傳病提供了一個早期、非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的方法。但應(yīng)該采用更加特異的抗滋養(yǎng)細(xì)胞抗體和更靈敏的PCR技術(shù)，以提高滋養(yǎng)細(xì)胞的檢出率。 第二部分：利用實時定

5、!ilPCR比較不同部位的經(jīng)宮頸獲取的胎兒細(xì)胞量 目的：利用實時定量PCR方法對經(jīng)宮頸不同部位獲取的胎兒細(xì)胞進(jìn)行檢測，確定更佳的取材部位，初步建立一套孕早期檢測伴性遺傳病的產(chǎn)前診斷方法。方法分別收集孕6.10周人工流產(chǎn)婦女的經(jīng)宮頸內(nèi)口和宮頸外口沖洗液各60例，提取DNA，對Y染色體的SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增和定量。人流后的絨毛采用直接法分析染色體核型確定流產(chǎn)胎兒性別。 結(jié)果：(1)經(jīng)宮頸內(nèi)口沖洗組，實時定量PCR檢測出15／2

6、1例(71.4﹪)已知男胎的SRY基因，2／39例已知女胎的SRY基因；經(jīng)宮頸外口沖洗組，實時定量PCR檢測10／27例(37﹪)已知男胎的SRY基因,2／32例已知女胎的SRY基因。經(jīng)宮頸內(nèi)口沖洗組的總性別正確預(yù)測率和男胎陽性率均顯著高于經(jīng)宮頸外口沖洗組(86.7﹪vs67．8﹪，P<0．05；71.4﹪Vs37﹪，P<0．05)。Q)實時定量PCR檢測經(jīng)宮頸內(nèi)口沖洗組SRY基因的拷貝數(shù)顯著高于經(jīng)宮頸外口沖洗組(1487．17+430

7、．45拷貝vs702.414-365．71拷貝,P<0．05)。 結(jié)論：經(jīng)宮頸獲取胎兒細(xì)胞為孕早期無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了一個可能途徑，經(jīng)宮頸內(nèi)口水平能比外口得到更多的胎兒細(xì)胞，但應(yīng)采取更加安全有效的取材方法。 第三部分：利用實時定量PCR比較兩種經(jīng)宮頸獲取胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞的方法 目的：采用實時定量PCR方法對經(jīng)宮頸沖洗和粘液抽吸獲取的胎兒細(xì)胞進(jìn)行定性定量分析，比較兩種取材方法的優(yōu)越性。 方法：分別收集孕6.10

8、周人工流產(chǎn)婦女的經(jīng)宮頸沖洗液和抽吸粘液各60例，提取宮頸分泌物中DNA，對Y染色體的SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增和定量。人流后的絨毛采用直接法分析染色體核型確定流產(chǎn)胎兒性別。 結(jié)果：(1)經(jīng)頸管沖洗組，實時定量PCR檢測出15／21例(71.4﹪)已知男胎的SRY基因，2／39例已知女胎的SRY基因；經(jīng)宮頸粘液抽吸組，實時定量PCR檢測21／24名(87.5﹪)已知男胎的SRY基因,6／33例已知女胎的SRY基因。兩組的總性別正確預(yù)測率和