HIV蛋白酶抑制劑體外噬菌體篩選模型的建立及初步研究.pdf

1、近年來，HIV感染在全球呈迅猛上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前臨床治療AIDS主要運(yùn)用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highlyactiveanti-retroviraltherapy,HAART)，可以明顯減少AIDS相關(guān)發(fā)病率和死亡率。然而對一種或多種抗逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和蛋白酶抑制劑(PI)藥物耐藥的HIV變異株的出現(xiàn)是影響HAART治療效果的主要因素。由于尚無有效的HIV疫苗問世，因此開發(fā)新一代的HIV蛋白酶抑制劑就具有更加緊迫的現(xiàn)實(shí)

2、意義. 本研究擬應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建針對HIV蛋白酶(PR)的適用于PI藥物大規(guī)模初篩的噬菌體體外篩選模型。本研究分為三個部分：首先體外構(gòu)建高效的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)、純化HIV-1型HXB2株P(guān)R的底物之一核殼蛋白(capsid,CA)與P2蛋白的融合蛋白CAP2，用于體外研究PR生物學(xué)功能；其次用HIVSF2PR切割靶蛋白CAP2NC和含固相化標(biāo)記的重組蛋白LD3-CAP2NC及其噬菌體表面展示蛋白，并體外使用

3、蛋白酶抑制劑(PI)抑制其切割作用；最后對HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之間切割位點(diǎn)進(jìn)行了隨機(jī)化并構(gòu)建其噬菌體展示文庫并用HIVPR對改文庫進(jìn)行篩選。 一、HIV-1型HXB2株P(guān)R靶蛋白CAP2在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及鑒定根據(jù)HIV-1HXB2株P(guān)R靶蛋白CAP2的DNA序列設(shè)計(jì)引物，用重疊延伸PCR方法合成使用大腸桿菌偏好密碼子的HIV-1PR的DNA編碼序列，用T/A克隆法將其插入pMD18-T載體進(jìn)行測序。將HIV

4、-1CAP2DNA克隆至原核表達(dá)載體PET32a(+)，在大腸桿菌BL21-TRXB中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni-NTA親和柱對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE鑒定表達(dá)及純化產(chǎn)物，并用HIV陽性血清進(jìn)行免疫反應(yīng)性的鑒定。序列測定顯示其編碼氨基酸序列與原始序列完全一致。所構(gòu)建的HIV-1PR原核表達(dá)質(zhì)粒PET32a(+)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)出相對分子質(zhì)量為26000的HIV-1PR蛋白，純化的目的蛋白濃度為6.65mg/ml。ELISA檢

5、測證實(shí)該蛋白與HIV陽性血清呈特異性的反應(yīng)。 二、噬菌體展示HIV靶蛋白體外蛋白酶切割模型的構(gòu)建應(yīng)用HIVSF2PR對靶蛋白CAP2NC、LD3-CAP2NC、LD3進(jìn)行一系列進(jìn)行切割分析。制備單克隆噬菌體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC，利用IgG將pCANTAB5S-LD3-CAP2NC噬菌體固定于酶標(biāo)板上，用HIVSF2PR進(jìn)行切割其展示蛋白，完成后檢測結(jié)合于板上的噬菌體數(shù)量，即為構(gòu)建展示P2/NC切割位點(diǎn)序列的噬

6、菌體體外蛋白酶切割模型。單克隆噬菌體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC滴度為3.0×1012TU/ml，序列分析該單克隆噬菌體包含完整的HIVGAG蛋白CAP2NC序列；LD3-CAP2NC，CAP2NC蛋白經(jīng)過與HIVSF2PR反應(yīng)后，電泳時出現(xiàn)一新條帶，證明此兩種蛋白能夠被HIVSF2PR特異性切割。相比于pCANTAB5S-LD3單克隆噬菌體，經(jīng)過與HIVSF2PR反應(yīng)后，結(jié)合于板上的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC

7、噬菌體數(shù)量明顯低于pCANTAB5S-LD3噬菌體，同時該反應(yīng)中表現(xiàn)的差異可被HIVPR抑制劑Indinavir抑制。 三、HIV-1Gag蛋白P2/NC蛋白酶切割位點(diǎn)序列的隨機(jī)化的噬菌體展示及篩選PCR擴(kuò)增制備重組HIV-1gag基因上的CAP2和NC片段，在CAP2片段5'端引入StuⅠ酶切位點(diǎn)，3'端用含隨機(jī)核苷酸序列的引物對PR切割位點(diǎn)處的氨基酸序列進(jìn)行隨機(jī)化；在NC片段5'端設(shè)計(jì)重疊區(qū)域，3'端引入SalⅠ酶切位點(diǎn)。應(yīng)

8、用OverlappingPCR將CAP2和NC片段拼接并克隆于噬菌體展示載體LD3-pCANTAB5S上，建立HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之間切割位點(diǎn)隨機(jī)化的噬菌體展示文庫。該噬菌體展示文庫庫容量為2.1×106，滴度為3.0×1012TU/ml,CAP2/NC片段插入率為52.1％；12個樣品的序列分析顯示切割位點(diǎn)中隨機(jī)化的核苷酸與氨基酸均呈隨機(jī)性分布；10個陽性單克隆噬菌體CAP2/NC-LD3-pCANTAB5S樣品中9個與

9、IgG特異結(jié)合。篩選結(jié)果顯示我們自己合成的HIVHBX2PR及HIVSF2PR對所構(gòu)建的文庫進(jìn)行切割篩選均未獲得預(yù)期結(jié)果，結(jié)合體外切割實(shí)驗(yàn)研究表明我們合成HIVHBX2PR無切割靶蛋白的活性，而HIVSF2PR存在著對噬菌體模型的非特異性切割，因此我們正在尋找受PR非特異性影響小的與人IgG結(jié)合的噬菌體，用于固相化標(biāo)記，建立有效的PR體外噬菌體切割篩選模型。 本研究成功合成并克隆了使用大腸桿菌偏好密碼子的HIV-1PR靶蛋白CA

10、P2的DNA編碼序列，在大腸桿菌中表達(dá)并純化了具有免疫學(xué)特性的HIV-1CAP2融合蛋白，并使用HIVSF2PR對底物蛋白及噬菌體展示表面的底物蛋白進(jìn)行了有效地切割，且該切割反應(yīng)可被PR抑制劑抑制，為利用該切割模型進(jìn)行HIVPR抑制劑類藥物的篩選提供了可靠的依據(jù)。同時對HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之間切割位點(diǎn)進(jìn)行了隨機(jī)化并構(gòu)建其噬菌體展示文庫，其庫容、多樣性、隨機(jī)性及IgG結(jié)合活性可滿足體外耐藥突變PR對文庫的切割篩選需要，為研究