HIV蛋白酶抑制劑體外噬菌體篩選模型的建立及初步研究.pdf

1、近年來，HIV感染在全球呈迅猛上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。目前臨床治療AIDS主要運用高效抗逆轉錄病毒療法(highlyactiveanti-retroviraltherapy,HAART)，可以明顯減少AIDS相關發(fā)病率和死亡率。然而對一種或多種抗逆轉錄酶(RT)和蛋白酶抑制劑(PI)藥物耐藥的HIV變異株的出現(xiàn)是影響HAART治療效果的主要因素。由于尚無有效的HIV疫苗問世，因此開發(fā)新一代的HIV蛋白酶抑制劑就具有更加緊迫的現(xiàn)實

2、意義. 本研究擬應用噬菌體展示技術，構建針對HIV蛋白酶(PR)的適用于PI藥物大規(guī)模初篩的噬菌體體外篩選模型。本研究分為三個部分：首先體外構建高效的原核表達載體，在大腸桿菌中表達、純化HIV-1型HXB2株PR的底物之一核殼蛋白(capsid,CA)與P2蛋白的融合蛋白CAP2，用于體外研究PR生物學功能；其次用HIVSF2PR切割靶蛋白CAP2NC和含固相化標記的重組蛋白LD3-CAP2NC及其噬菌體表面展示蛋白，并體外使用

3、蛋白酶抑制劑(PI)抑制其切割作用；最后對HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之間切割位點進行了隨機化并構建其噬菌體展示文庫并用HIVPR對改文庫進行篩選。 一、HIV-1型HXB2株PR靶蛋白CAP2在大腸桿菌中的表達、純化及鑒定根據(jù)HIV-1HXB2株PR靶蛋白CAP2的DNA序列設計引物，用重疊延伸PCR方法合成使用大腸桿菌偏好密碼子的HIV-1PR的DNA編碼序列，用T/A克隆法將其插入pMD18-T載體進行測序。將HIV

4、-1CAP2DNA克隆至原核表達載體PET32a(+)，在大腸桿菌BL21-TRXB中進行誘導表達，用Ni-NTA親和柱對表達蛋白進行純化，SDS-PAGE鑒定表達及純化產(chǎn)物，并用HIV陽性血清進行免疫反應性的鑒定。序列測定顯示其編碼氨基酸序列與原始序列完全一致。所構建的HIV-1PR原核表達質粒PET32a(+)，經(jīng)IPTG誘導后，表達出相對分子質量為26000的HIV-1PR蛋白，純化的目的蛋白濃度為6.65mg/ml。ELISA檢

5、測證實該蛋白與HIV陽性血清呈特異性的反應。 二、噬菌體展示HIV靶蛋白體外蛋白酶切割模型的構建應用HIVSF2PR對靶蛋白CAP2NC、LD3-CAP2NC、LD3進行一系列進行切割分析。制備單克隆噬菌體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC，利用IgG將pCANTAB5S-LD3-CAP2NC噬菌體固定于酶標板上，用HIVSF2PR進行切割其展示蛋白，完成后檢測結合于板上的噬菌體數(shù)量，即為構建展示P2/NC切割位點序列的噬

6、菌體體外蛋白酶切割模型。單克隆噬菌體pCANTAB5S-LD3-CAP2NC滴度為3.0×1012TU/ml，序列分析該單克隆噬菌體包含完整的HIVGAG蛋白CAP2NC序列；LD3-CAP2NC，CAP2NC蛋白經(jīng)過與HIVSF2PR反應后，電泳時出現(xiàn)一新條帶，證明此兩種蛋白能夠被HIVSF2PR特異性切割。相比于pCANTAB5S-LD3單克隆噬菌體，經(jīng)過與HIVSF2PR反應后，結合于板上的pCANTAB5S-LD3-CAP2NC

7、噬菌體數(shù)量明顯低于pCANTAB5S-LD3噬菌體，同時該反應中表現(xiàn)的差異可被HIVPR抑制劑Indinavir抑制。 三、HIV-1Gag蛋白P2/NC蛋白酶切割位點序列的隨機化的噬菌體展示及篩選PCR擴增制備重組HIV-1gag基因上的CAP2和NC片段，在CAP2片段5'端引入StuⅠ酶切位點，3'端用含隨機核苷酸序列的引物對PR切割位點處的氨基酸序列進行隨機化；在NC片段5'端設計重疊區(qū)域，3'端引入SalⅠ酶切位點。應

8、用OverlappingPCR將CAP2和NC片段拼接并克隆于噬菌體展示載體LD3-pCANTAB5S上，建立HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之間切割位點隨機化的噬菌體展示文庫。該噬菌體展示文庫庫容量為2.1×106，滴度為3.0×1012TU/ml,CAP2/NC片段插入率為52.1％；12個樣品的序列分析顯示切割位點中隨機化的核苷酸與氨基酸均呈隨機性分布；10個陽性單克隆噬菌體CAP2/NC-LD3-pCANTAB5S樣品中9個與

9、IgG特異結合。篩選結果顯示我們自己合成的HIVHBX2PR及HIVSF2PR對所構建的文庫進行切割篩選均未獲得預期結果，結合體外切割實驗研究表明我們合成HIVHBX2PR無切割靶蛋白的活性，而HIVSF2PR存在著對噬菌體模型的非特異性切割，因此我們正在尋找受PR非特異性影響小的與人IgG結合的噬菌體，用于固相化標記，建立有效的PR體外噬菌體切割篩選模型。 本研究成功合成并克隆了使用大腸桿菌偏好密碼子的HIV-1PR靶蛋白CA

10、P2的DNA編碼序列，在大腸桿菌中表達并純化了具有免疫學特性的HIV-1CAP2融合蛋白，并使用HIVSF2PR對底物蛋白及噬菌體展示表面的底物蛋白進行了有效地切割，且該切割反應可被PR抑制劑抑制，為利用該切割模型進行HIVPR抑制劑類藥物的篩選提供了可靠的依據(jù)。同時對HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之間切割位點進行了隨機化并構建其噬菌體展示文庫，其庫容、多樣性、隨機性及IgG結合活性可滿足體外耐藥突變PR對文庫的切割篩選需要，為研究