不同時機(jī)轉(zhuǎn)染基因?qū)ν孟骂M骨牽引區(qū)成骨因子表達(dá)的影響.pdf

1、背景:牽引成骨（distraction osteogenesis，DO）被認(rèn)為是體內(nèi)組織工程技術(shù)的最佳類型，已廣泛應(yīng)用于臨床，矯治了四肢及常規(guī)正頜外科手術(shù)難以矯治的諸多復(fù)雜顱頜面畸形、骨缺損等。盡管如此，DO也存在某些不足之處，固定治療周期長，牽引器長期留置體內(nèi)可能導(dǎo)致如局部感染、牽引器或螺釘松脫、骨折、局部延遲愈合及給病人和家屬帶來心理負(fù)擔(dān)和諸多煩惱。為此，許多學(xué)者進(jìn)行了促進(jìn)下頜骨牽引區(qū)新骨生成的相關(guān)研究。
　　目的:本研究在前

2、期研究的基礎(chǔ)上，在不同時點通過電穿孔技術(shù)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pIRES-hBMP2-hVEGF165導(dǎo)入兔下頜骨牽引間隙內(nèi)，觀察基因轉(zhuǎn)染后成骨因子在下頜骨牽引區(qū)的局部表達(dá)，探索基因?qū)胱罴褧r機(jī)的理論依據(jù)。
　　方法:選用48只6月大小、健康新西蘭大白兔，隨機(jī)分為四組每組12只，在全麻下行雙側(cè)下頜骨截骨，植入兔專用下頜骨牽引器，外置牽引器旋轉(zhuǎn)桿，分層縫合切口。經(jīng)過3d潛伏期后開始牽引，牽引速度0.8mm/d，頻率1次/d，連續(xù)牽引10d

3、后進(jìn)入固定期。各組在不同階段進(jìn)行基因?qū)耄?A、B、C組分別于術(shù)后即刻（潛伏期）、術(shù)后3d（牽引開始時）、術(shù)后14d（牽引結(jié)束固定開始）在雙側(cè)牽引區(qū)注射2μg，（0.1μg/μl）重組質(zhì)粒pIRES-hBMP2-hVEGF165;A、B、C三組均予電脈沖刺激（電脈沖參數(shù):電壓是200V，電容是10μF，頻率是0.2Hz，平均脈沖寬度是2.7ms，單脈沖刺激，共為6個脈沖，3個脈沖更換正負(fù)極。），D組單純牽引不行基因轉(zhuǎn)染。各組分別在固定第

4、7、14、28d處死4只實驗動物，獲取延長的下頜骨行組織學(xué)觀察牽引區(qū)新骨生成情況，免疫組化檢測BMP2、TGF-β1的表達(dá)情況，并用CMIAS系列多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對BMP2和TGF-β1的平均光密度和積分光密度分析。
　　結(jié)果:組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，固定期第7天，截骨部位有軟骨痂和鈣化組織形成的早期橋連，并伴有軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞;第14天，軟骨細(xì)胞和狹長的成纖維細(xì)胞在牽引間隙在形態(tài)學(xué)上被鑒別，并且在牽引方向上生長;第28天

5、，牽引間隙的骨碎片產(chǎn)生橋接，伴隨著牽引間隙明顯的骨和鈣化組織沉積。B組與A、C、D組比較間隙內(nèi)有更多的新生血管、間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞等成分。
　　免疫組化顯示:1、BMP-2表達(dá)于細(xì)胞胞漿中。固定期第7天，BMP-2主要表達(dá)于肉芽組織中的炎細(xì)胞（如間質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞（骨端骨細(xì)胞、骨痂骨細(xì)胞）以及周圍結(jié)締組織中。固定期第14天，BMP-2陽性染色主要在肥厚性軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中

6、，與牽引方向排列一致新生的幼稚骨小梁表面成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和周圍結(jié)締組織中。在固定期第28天，BMP-2陽性染色逐漸減少，主要在成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中。半定量分析發(fā)現(xiàn)，在固定期第7天時，四組BMP-2表達(dá)達(dá)到高峰。其他3組比較，B組(0.31±0.04，0.68±0.06)是最強(qiáng)的，其中有顯著差異(P＜0.01，P＜0.05)。C組和A、D之間仍有顯著性差異(P＜0.05)，A與D組相比，有顯著差異(P＜0.05)。在固定期14

7、天，陽性染色細(xì)胞的數(shù)量減少，B組與A、C、D之間具有顯著差異(P＜0.05)。BMP-2在28天的表達(dá)很弱，各組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.TGF-β1表達(dá)各個時間點上與BMP-2密切相關(guān)。在固定期第7天，TGF-β1表達(dá)主要在成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和沿著截骨邊緣的軟骨細(xì)胞。還有大量不明確的間充質(zhì)細(xì)胞陽性染色。TGF-β1的表達(dá)在固定期第14天和28天BMP-2表達(dá)相似。在第14天，TGF-β1在肥厚性軟骨

8、細(xì)胞，骨細(xì)胞和再生的成骨細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。在第28天，TGF-β1在骨痂表面成骨細(xì)胞以及新生的編織骨痂骨細(xì)胞染色仍呈陽性，而在肉芽組織中的陽性染色的細(xì)胞減少明顯。TGF-β1在四組在不同時間的表達(dá)強(qiáng)度在表2中列出。半定量分析發(fā)現(xiàn)，在固定期第7天時，四組TGF-β1表達(dá)達(dá)到高峰，B組(0.37±0.07，0.90±0.06)是最強(qiáng)的其次是C組(0.22±0.02，0.69±0.02)和A組(0.16±0.05，0.41±0.03)

9、。B組與其余各組間有顯著差異(P＜0.01，P＜0.05)。在14-28天基因轉(zhuǎn)染后，統(tǒng)計分析TGF-β1在不同組織的表達(dá)情況類似BMP-2的情況，在固定期14天，陽性染色細(xì)胞的數(shù)量減少，B組與A、C、D之間具有顯著差異(P＜0.05)，28天的表達(dá)很弱，各組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:在下頜骨牽引區(qū)局部進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染能上調(diào)成骨因子BMP2、TGF-β1的表達(dá)，不同時機(jī)轉(zhuǎn)染基因效果不同，在牽引期進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染BMP