髁突骨軟骨交界血管新生在顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)病(osteoarthritis,OA)是一種發(fā)生于滑膜關(guān)節(jié)的慢性進(jìn)行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性變、骨贅形成、滑膜炎癥為主要特征。有關(guān)OA的發(fā)病機(jī)制至今尚未明了。最近的研究顯示軟骨血管新生在OA發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。但目前此方面的研究多集中于膝關(guān)節(jié)OA，且對(duì)血管新生的發(fā)生機(jī)制探討不足。顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibularjoint,TMJ）在發(fā)育及構(gòu)造上與全身其他滑膜關(guān)節(jié)都存在著顯著差別，作為OA的常見(jiàn)發(fā)病關(guān)節(jié)，血管

2、新生究竟在TMJ-OA的病理發(fā)展中扮演了何種角色目前還沒(méi)有研究。本研究擬通過(guò)漸進(jìn)性咬合紊亂建立大鼠TMJ-OA病理模型，檢測(cè)髁突骨軟骨交界血管數(shù)量的改變及其與OA病理改變的關(guān)系，并進(jìn)一步從基因及蛋白水平
　　檢測(cè)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)水平，此外還利用病毒載體技術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及低氧誘導(dǎo)因子1表達(dá)的影響，以探討髁突骨軟骨交界血管新生在TMJ-OA發(fā)展中的病理作用及其出現(xiàn)的可能機(jī)制，以期為尋找新的TMJ-OA防

3、治途徑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一漸進(jìn)性咬合紊亂對(duì)大鼠髁突軟骨影響的長(zhǎng)期觀察即大鼠TMJ-OA動(dòng)物模型的建立
　　目的：研究漸進(jìn)性咬合紊亂對(duì)大鼠TMJ髁突的長(zhǎng)期影響。材料和方法：8周齡雌性SD大鼠24只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。利用分牙皮圈將實(shí)驗(yàn)組大鼠右下及左上第一磨牙移動(dòng)約1mm，在第一次分牙4周后，在右下及左上第二三磨牙間重復(fù)相同操作以使第三磨牙遠(yuǎn)中移動(dòng)。對(duì)照組除不進(jìn)行分牙操作，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第2

4、0周和24周末，分別處死每組各一半大鼠。分別命名為20周組及24周組。對(duì)髁突標(biāo)本進(jìn)行處理，制成切片。病理染色，鏡下觀察，并利用軟件對(duì)髁突軟骨厚度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠原有的尖窩咬合關(guān)系遭到破壞，形成實(shí)驗(yàn)性的咬合紊亂。病理染色顯示對(duì)照組軟骨表面完整，細(xì)胞分層清晰，排列整齊，分布均勻；實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)類(lèi)OA樣病理改變：軟骨表面連續(xù)性中斷，破損；肥大細(xì)胞簇集成島狀；軟骨細(xì)胞釘突樣增生進(jìn)入軟骨下骨；出現(xiàn)無(wú)細(xì)胞區(qū)域；類(lèi)骨贅樣增生；細(xì)胞外基質(zhì)酸性粘多

5、糖著色不均勻。與對(duì)照組相比，20周時(shí)實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨全層厚度出現(xiàn)顯著增厚（P<0.05），但在24周兩者沒(méi)有顯著性差異。而實(shí)驗(yàn)組纖維層和鈣化層厚度在20周和24周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比都出現(xiàn)明顯增加（P<0.05）。結(jié)論：在較長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)漸進(jìn)性咬合紊亂依然對(duì)髁突軟骨產(chǎn)生了持久的破壞作用。同時(shí)潮線的確認(rèn)也為下一步實(shí)驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二TMJ-OA大鼠髁突骨軟骨交界處血管數(shù)量檢測(cè)
　　目的：本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)漸進(jìn)性咬合紊亂建立大

6、鼠TMJ-OA病理模型，檢測(cè)髁突骨軟骨交界血管數(shù)量的改變及其與OA病理改變的關(guān)系，以期為尋找TMJ-OA防治途徑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法：漸進(jìn)性咬合紊亂大鼠模型建立后，第20周和24周末分別處死每組各一半大鼠。HE染色后，對(duì)髁突中后部終止于鈣化軟骨層的血管數(shù)量以及突破潮線進(jìn)入非鈣化軟骨層的血管通道數(shù)量分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)OA病變進(jìn)行評(píng)估。利用CD34免疫熒光染色進(jìn)一步對(duì)髁突骨軟骨交界的血管進(jìn)行觀察評(píng)估。結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照

7、組中來(lái)自于軟骨下骨的血管通道最遠(yuǎn)到達(dá)鈣化軟骨層，均被限制于潮線以下；實(shí)驗(yàn)組可觀測(cè)到富含紅細(xì)胞的血管通道突破潮線侵入非鈣化軟骨，且侵入位置周?chē)能浌羌?xì)胞排列異常紊亂，或出現(xiàn)軟骨細(xì)胞壞死。CD34免疫熒光顯示，位于血管通道中的血管在實(shí)驗(yàn)組中可抵達(dá)鈣化軟骨深層，直至突破潮線侵入非鈣化軟骨。與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，20及24周實(shí)驗(yàn)組終止于鈣化軟骨層血管數(shù)量及突破潮線進(jìn)入非鈣化軟骨的血管數(shù)量均出現(xiàn)顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：從不同角度首次證實(shí)T

8、MJ-OA病理進(jìn)程中存在骨軟骨交界的血管新生現(xiàn)象，且與髁突軟骨的OA病變存在直接聯(lián)系。
　　實(shí)驗(yàn)三TMJ-OA大鼠髁突血管生成相關(guān)因子蛋白及基因水平的表達(dá)檢測(cè)
　　目的：研究由何種機(jī)制誘發(fā)髁突骨軟骨交界血管新生現(xiàn)象。材料和方法：漸進(jìn)性咬合紊亂大鼠模型建立后，第20周和24周末分別處死每組各一半大鼠。取出雙側(cè)TMJ，左側(cè)髁突頭進(jìn)行RNA提取，右側(cè)TMJ制成切片。利用Real-timePCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)樣本血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

9、（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF），結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF），基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9，MMP9），及軟骨調(diào)節(jié)素I（chondromodulin-I,CHM-I）的表達(dá)變化。結(jié)果：免疫組化染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中，VEGF，CTGF及MMP9主要表達(dá)于骨軟骨交界處的鄰近組織中，包括肥大軟骨細(xì)胞，增

10、殖層軟骨細(xì)胞，血細(xì)胞及鄰近的骨細(xì)胞中；然而CHM-I則更多表達(dá)于肥大細(xì)胞淺層及增殖層軟骨細(xì)胞中，在深層軟骨細(xì)胞中表達(dá)較少。24周實(shí)驗(yàn)組CTGF，MMP9，CHM-I的mRNA及蛋白水平明顯上調(diào)（P<0.05）；20周實(shí)驗(yàn)組中VEGF和CTGF的蛋白表達(dá)與同齡對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)論：漸進(jìn)性咬合紊亂導(dǎo)致咬合力的大小，方向，分布都出現(xiàn)改變，通過(guò)牙周-神經(jīng)反饋機(jī)制對(duì)TMJ產(chǎn)生異常應(yīng)力負(fù)荷。異常應(yīng)力可能促使髁突軟骨細(xì)胞、骨軟骨交

11、界血管通道中的血細(xì)胞及鄰近的骨細(xì)胞分泌VEGF，CTGF，MMP9等促血管生成因子，并通過(guò)擴(kuò)散及運(yùn)輸作用大量聚集于骨軟骨交界區(qū)域，形成一個(gè)有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖的微環(huán)境，并最終導(dǎo)致了骨軟骨交界的血管新生。反應(yīng)性CHM-I的表達(dá)增強(qiáng)可能在增殖層或肥大層淺層中和促血管生成因子的作用，但其在深層軟骨的表達(dá)減少可能也是血管侵入的原因之一。
　　實(shí)驗(yàn)四ATDC5細(xì)胞系的軟骨細(xì)胞化誘導(dǎo)鑒定及重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-VEGF對(duì)其增殖活性

12、及低氧誘導(dǎo)因子1表達(dá)的影響研究
　　目的：誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，檢測(cè)VEGF對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-induciblefactor1，HIF-1）表達(dá)的影響。材料和方法：利用胰島素鐵硒傳遞蛋白對(duì)ATDC5細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)，并分別利用阿爾新藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫熒光染色對(duì)其進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。將編碼有VEGF基因的rAAV載體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞，使用四甲基噻唑氮藍(lán)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，并利用免疫熒

13、光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果及軟骨細(xì)胞HIF-1的表達(dá)變化。結(jié)果：開(kāi)始誘導(dǎo)后1周，細(xì)胞逐漸凝集，開(kāi)始分泌細(xì)胞外基質(zhì)酸性粘多糖；誘導(dǎo)后2周，細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原，酸性粘多糖分泌進(jìn)一步增多；誘導(dǎo)后3周，可見(jiàn)軟骨結(jié)節(jié)。rAAV-VEGF可成功導(dǎo)入軟骨細(xì)胞，導(dǎo)入后細(xì)胞可分泌VEGF。VEGF轉(zhuǎn)染可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并使HIF-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論：ATDC5細(xì)胞在特定條件下可誘導(dǎo)成熟為軟骨細(xì)胞，VEGF可反向增強(qiáng)軟骨細(xì)胞HIF-1的生成，推測(cè)在OA發(fā)生發(fā)展中