PDX-1、NeuroD1及MafA轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及小鼠iPS細(xì)胞制備胰島素分泌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察胰島素轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵調(diào)控基因PDX-1、NeuroD1及MafA轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mBMSCs)和小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)后,能否定向分化為胰島素分泌細(xì)胞,探索體外基因轉(zhuǎn)染制備胰島素分泌細(xì)胞用于移植治療1型糖尿病的可行性。
　　方法：
　　(1)全基因合成小鼠PDX-1、NeuroD1及MafA基因(以下簡(jiǎn)稱三基因)編碼區(qū)域序列并測(cè)序。將目的基因片段分別與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列-綠色熒光蛋白(IRES-G

2、FP)進(jìn)行PCR拼接,得到目的基因與GFP的共表達(dá)片斷,并將含目的基因序列的質(zhì)粒重組到腺病毒載體上。分別將含目的基因PDX-1、NeuroD1及MafA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,制備重組腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP,通過(guò)免疫法檢測(cè)腺病毒液滴度。
　　(2)體外分離培養(yǎng)及鑒定mBMSCs;小鼠Oct4、Sox2、Klf4及cMyc經(jīng)Tet-

3、On慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs),挑選并擴(kuò)增克隆。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定,干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1檢測(cè),體內(nèi)外三胚層分化等實(shí)驗(yàn)篩選鑒定iPSCs。
　　(3)重組腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染mBMSCs及小鼠iPSCs。轉(zhuǎn)染獲得的細(xì)胞分別用RT-PCR檢測(cè)胰島β細(xì)胞功能基因的表達(dá);免疫熒光檢測(cè)胰島素蛋

4、白的表達(dá)及定位;ELISA檢測(cè)不同濃度葡萄糖刺激下胰島素的分泌量。
　　(4)三基因轉(zhuǎn)染的mBMSCs及小鼠iPSCs定向分化為胰島素分泌細(xì)胞后,移植到糖尿病小鼠模型肝臟,免疫組化檢測(cè)其在肝內(nèi)胰島素的表達(dá);空腹血糖監(jiān)測(cè)檢測(cè)移植細(xì)胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的功能發(fā)揮。
　　結(jié)果：
　　(1)重組腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP經(jīng)PacI單酶切

5、后凝膠電泳顯示會(huì)形成約2,000bp的小條帶及腺病毒載體將近35,000bp的大條帶,與預(yù)期及測(cè)序結(jié)果一致,表明含三基因的同源重組腺病毒載體構(gòu)建正確。
　　(2)LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc轉(zhuǎn)染MEFs后,成功獲取iPSCs,能形成邊緣光整的致密克隆;表達(dá)干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1;在體內(nèi)外能分化為三胚層組織。
　　(3)Ad-mPDX-1-IRES-

6、GFP、Ad–mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染的mBMSCs及小鼠iPSCs能分化為胰島素分泌細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示其胰島β細(xì)胞功能基因的表達(dá)與小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6類似;免疫熒光檢測(cè)見細(xì)胞胞漿內(nèi)有胰島素合成;ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞對(duì)不同濃度的葡萄糖有較好的反應(yīng)性。
　　(4)免疫組化鏡檢發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞注射區(qū)域的肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見相對(duì)集中的棕黃色細(xì)胞,表明移植細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)胰島素

7、蛋白;空腹血糖監(jiān)測(cè)顯示移植細(xì)胞能夠控制糖尿病小鼠的高血糖,在體內(nèi)發(fā)揮良好的治療作用。
　　結(jié)論：
　　(1)LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc能成功將MEFs重編程為iPS細(xì)胞。
　　(2)胰島素轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵調(diào)控基因PDX-1、NeuroD1和MafA三者能協(xié)同作用,促進(jìn)mBMSCs及小鼠iPSCs定向分化為具有顯著的胰島素合成和分泌能力的胰島素分泌細(xì)胞。
　　(3)