PDX-1基因轉染人骨髓間充質干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞.pdf

1、目的：通過人骨髓間充質干細胞(MSCs)的定向誘導，探討成骨等多分化潛能。利用PDX-1基因轉染誘導人骨髓MSCs對其進行基因修飾，使之分化為能分泌胰島素的細胞，探討人骨髓MSCs在糖尿病治療領域的價值。 方法：1.Percoll密度梯度離心法從成人骨髓血中分離MSCs;第3代細胞經(jīng)CD44抗體、CD45抗體、CD34抗體等免疫熒光方法鑒定；通過細胞生長曲線及電鏡觀察其生物學性狀。2.第3代細胞采用含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維

2、生素C誘導成骨細胞，堿性磷酸酶(ALP)染色，觀察MSCs的形態(tài)變化，未誘導組作為平行對照。3.PT-PCR方法擴增出入PDX-1基因cDNA片段，構建了含PDX-1基因的重組載體PEGFP-N1-PDX-1，并轉染骨髓間充質干細胞。用熒光顯微鏡觀察形態(tài)變化，免疫熒光鑒定轉染細胞PDX-1蛋白的表達，雙硫腙染色鑒定懸浮細胞團，電化學發(fā)光法法檢測轉基因細胞分泌胰島素情況。 結果：通過測序、PCR、酶切等確定PDX-1基因已正確插入

3、重組質粒，通過熒光顯微鏡觀察有綠色熒光蛋白的表達，證實有效轉染人骨髓間充質干細胞。轉染后1周后的細胞PDX-1蛋白表達陽性。轉染2周后，人骨髓MSCs可見半懸浮的胰島樣細胞團，雙硫腙染色為陽性。電化學發(fā)光法測定轉染后細胞高糖與低糖刺激后的胰島素分泌量。 結論：成功構建了含人PDX-1基因的重組載體PEGFP-N1-PDX-1。PDX-1基因重組載體能夠導入人骨髓MSCs并穩(wěn)定表達，且分化為胰島素分泌細胞。為表達PDX-1基因的骨