趨化因子受體CCR5親和短肽的篩選及活性研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文趨化因子受體CCR5親和短肽的篩選及活性研究姓名：王芳宇申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：羅進(jìn)賢20050609經(jīng)潮霉素B(300rag／L)進(jìn)行選擇篩選，以獲得穩(wěn)定表達(dá)CCR5的CHO細(xì)胞(CHO／CCR5細(xì)胞)，并采用流式細(xì)胞技術(shù)對CHO／CCK5細(xì)胞進(jìn)行鑒定然后采用噬菌體隨機(jī)12肽庫對CHO／CCR5細(xì)胞進(jìn)行親和篩選，共進(jìn)行四輪吸附一洗脫一擴(kuò)增的篩選過程。隨機(jī)挑取四輪篩選后的單個噬菌體克隆進(jìn)

2、行ELISA分析，30個克隆全部為陽性。測序結(jié)果表明，30個噬菌體克隆含有9種不同外源插入氨基酸序列。其中17個克隆含有相同的外源插入片段，其編碼的氨基酸序列為AFDWTFVPSLIL。氨基酸序列比對顯示，AFDWTFVPSLIL與趨化因子或已知的蛋白質(zhì)不具有一級結(jié)構(gòu)上的周源性。9種不同插入序列的噬菌體被用于進(jìn)一步的結(jié)合活性研究，結(jié)果顯示含AFDWIFVPSLIL外源肽的噬菌體對CHO／CCP5細(xì)胞的結(jié)合效率大約是對CHO細(xì)胞結(jié)合效率的

3、1000倍；或者是其它8個噬菌體對CHO／CCR5細(xì)胞結(jié)合效率的20～60倍。同時，含AFrlw邛vPsuL外源肽的噬菌體對RANTES與CHO／CCR5細(xì)胞的結(jié)合具有明顯的抑制作用，其抑制率可達(dá)70％左右；而其它噬菌體則只有很小的抑制作用。此外，含AFDWrFWSLIL#源肽的噬菌體能明顯抑制2D7與CHO／CCR5細(xì)胞的結(jié)合，而其它8個噬菌體則沒有這種抑制作用。說明含AFDWTFVPSLIL外源肽的噬萄體具有最離的與CCR5特異性結(jié)

4、合活性。為了證明噬菌體中插入的外源肽在其中所起的作用，我們合成了多肽AFD嗍SLIL，并迸一步分析其功能活性。實驗結(jié)果顯示，合成膚對2D7與CHO／CCR5細(xì)胞和PBMCs的結(jié)合具有明顯的抑制作用，而對3A9則沒有。推斷該膚是與CCR5的第二外環(huán)結(jié)合。而且，合成馱能降低鼬蟠巾巨S與CHO／CCR5細(xì)胞和PBMCs的結(jié)合，且里劑量依賴性，其I島。分別為36mg／L(256／“mol／L)和49mg／L(348弘mol／L)。另外，合成肽(