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文檔簡介
1、該文主要針對使用噬菌體展示系統(tǒng)獲得目標蛋白質(zhì)的親和配基和將該配基應(yīng)用于目標蛋白質(zhì)的親和色譜分離進行了研究.首先以溶菌酶為目標蛋白質(zhì)篩選七肽噬菌體展示庫,在借鑒傳統(tǒng)肽庫篩選方法的基礎(chǔ)上,建立了一種新型篩選方法—交替洗脫法,即使用甘氨酸緩沖液和高濃度目標蛋白質(zhì)溶液輪流對結(jié)合于蛋白質(zhì)表面的噬菌體進行洗脫.通過與其它多種洗脫方法進行比較,以及將每輪實驗各次洗脫液中噬菌體對目標蛋白質(zhì)的親和力的對比,證明該方法能夠有效回收使用其它操作方法可能丟失的
2、高親和力噬菌體,而且可以大幅度縮短獲得目標配體的時間,同時具有簡便易行等優(yōu)點.利用新建立的交替洗脫法,使用其它目標蛋白質(zhì)對噬菌體展示肽庫進行篩選,又獲得了對胰島素和核糖核酸酶A具有高親和力的噬菌體.選擇與目標蛋白質(zhì)親和力不等(高等、中等、低等)的多個噬菌體進行DNA測序,獲得相應(yīng)氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)與溶菌酶、胰島素和核糖核酸酶A親和性最高的噬菌體展示肽序列均為HWWWPAS,將產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因進行了分析,同時還對不同序列展示肽與目標蛋白質(zhì)的
3、親和吸附機制進行了探討.合成上述高親和性肽段,并固定于瓊脂糖基質(zhì)上裝填親和色譜柱,研究了不同蛋白在親和色譜柱上的吸附行為.通過調(diào)節(jié)流動相的pH值和離子強度,并使用尿素和乙二醇分別對吸附蛋白進行洗脫,詳細研究了吸附效果最好的目標蛋白質(zhì)(胰島素)與肽配基之間的親和吸附機理,發(fā)現(xiàn)靜電作用和氫鍵是二者之間產(chǎn)生親和吸附的主要作用力,而疏水相互作用對該親和幾乎沒有貢獻.進一步考察了操作流速對胰島素在肽配基親和柱上吸附的影響,測定計算了胰島素在親和柱
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