OLC1的泛素化降解機制研究以及β-catenin在人食管鱗癌中的表達和預后分析.pdf

1、OLC1(overexpressed in lung cancer)是一個潛在的原癌基因,在人肺癌和食管鱗癌中均發(fā)現(xiàn)有異常高表達。已有報道證實OLC1(又名Ist1)在有絲分裂的最后一步胞質(zhì)分裂中發(fā)揮了重要作用。本室前期研究工作提示OLC1可能是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。
　　 在本文第一部分的研究中,我們首先采用血清饑餓、Nocodazole處理的方式將細胞同步化并釋放24h,經(jīng)Western Blot檢測后第一次證明了O

2、LC1的蛋白表達具有細胞周期依賴性。隨后,使用蛋白合成抑制劑CHX處理細胞,研究結(jié)果表明OLC1是一個短效蛋白。再加入蛋白酶體抑制劑MG132與CHX共同處理細胞,并檢測了OLC1與泛素之間的相互作用,結(jié)果證實OLC1是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。我們將OLC1蛋白的序列經(jīng)BLAST后在其第12-20位氨基酸處發(fā)現(xiàn)了一個破壞框結(jié)構(gòu)域Destruction Box,而該D-box恰好是后期促進復合體APC/C(AnaphasePromo

3、ting Complex/Cyclosome)特異性識別的結(jié)構(gòu)域。為了證實介導OLC1降解的泛素連接酶E3就是APC/C,我們使用IP實驗來檢測OLC1與APC/C的亞基APC2之間是否存在相互作用,得到了陽性結(jié)果。此外,通過轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒或者siRNA敲降技術(shù)來上調(diào)/下調(diào)與APC/C關(guān)系緊密的共激活因子Cdc20/Cdh1的蛋白水平后,發(fā)現(xiàn)Cdc20/Cdh1可以加快OLC1的降解。最后,我們還構(gòu)建了D-box序列突變的OLC1質(zhì)粒來研

4、究其降解機制,研究發(fā)現(xiàn)降解結(jié)構(gòu)域突變體可以大大增強OLC1蛋白的穩(wěn)定性,并且轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后可以引起細胞生長速度加快、克隆形成能力增強。
　　 在本文第二部分的研究中,我們通過組織芯片、免疫化學方法檢測211例手術(shù)切除的人食管鱗癌(ESCC)術(shù)后標本中β-catenin的表達情況。研究發(fā)現(xiàn),β—catenin在人食管鱗癌組織中以細胞漿定位為主,其表達陽性率(64.5％)要明顯高于癌旁正常組織(5.7％,P<0.05)。同時,應用X2

5、檢驗分析了β-catenin的表達與臨床病理特征間的相關(guān)性,應用Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)β-catenin高表達的食管鱗癌病人預后較差(P=0.010),接下來通過Cox多因素分析證實β-catenin是食管鱗癌病人的一個獨立的預后因素(P=0.026)。
　　 綜上所述,第一部分的研究證實了OLC1的蛋白表達具有細胞周期依賴性,OLC1是通過APC/C介導的泛素-蛋白酶體途徑降解的。另外,第二部分的研究證實β-ca