Migfilin在食管鱗癌中的表達(dá)差異和功能研究.pdf

1、Migfilin是LIM結(jié)構(gòu)域家族成員，主要位于胞漿中，介導(dǎo)蛋白之間的相互作用，參與局部黏附和細(xì)胞骨架之間的聯(lián)系，從而影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。Migfilin還可通過RNA剪切和鈣離子激活的方式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 通過免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)migfilin在食管癌和正常組織中存在表達(dá)差異，采用Westernblot的方法進(jìn)一步在蛋白水平上驗(yàn)證了這一結(jié)果。此外，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR的方法還發(fā)現(xiàn)，migfil

2、in的表達(dá)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系，這表明migfilin的表達(dá)可能與食管癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。
　　 為了研究migfilin在食管癌中的功能，我們將migfilin真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至migfilin低表達(dá)的食管癌細(xì)胞系KYSE450中并建立了穩(wěn)定高表達(dá)migfilin的KYSE450亞克隆細(xì)胞。功能研究表明，migfilin過表達(dá)不影響細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)，但可促進(jìn)細(xì)胞與胞外基質(zhì)成分Fibrone

3、ctin之間的黏附，并可抑制細(xì)胞的穿膜能力以及細(xì)胞對基質(zhì)的侵襲能力。免疫熒光顯示，migfilin過表達(dá)的細(xì)胞極性減弱，偽足增多。此外，應(yīng)用siRNA在migfilin高表達(dá)的食管癌細(xì)胞系KYSE150細(xì)胞中敲降migfilin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)migfilin的表達(dá)被干擾后細(xì)胞侵襲和遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。
　　 為進(jìn)一步揭示migfilin引起細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和形態(tài)改變的分子機(jī)理，我們檢測了migfilin的表達(dá)改變對與細(xì)胞黏附和細(xì)胞骨架

4、結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的一系列分子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在migfilin過表達(dá)的細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)在293T細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染migfilin抑制了β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性。經(jīng)進(jìn)一步研究顯示migfilin過表達(dá)所引起的β-catenin表達(dá)下調(diào)與其被GSK-3β磷酸化及隨后的泛素化-蛋白酶降解相關(guān)。Migfilin通過促進(jìn)GSK3β與β-catenin的相互作用，從而增強(qiáng)了GSK3β對β-catenin的磷酸化，磷酸化后的β-

5、catenin將易于被E3泛素連接酶β-TrCP所識別，進(jìn)入泛素化-蛋白酶降解途徑。敲降migfilin，表達(dá)GSK3β磷酸化位點(diǎn)突變的β-catenin，加入GSK3β抑制劑LiC1或蛋白酶抑制劑MG132能使胞漿β-catenin表達(dá)上升，并恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，說明migfilin是通過GSK3β和蛋白酶途徑來調(diào)節(jié)β-catenin的蛋白穩(wěn)定性的。此外，migfilin還可以通過抑制PI3K/Akt通路來上調(diào)GSK3β的酶活性，從而降低

6、β-catenin的蛋白表達(dá)。而加入PI3K的抑制劑LY294002，則完全廢除了敲降migfilin所引起的PI3K/Akt通路上的相關(guān)信號分子的激活。在migfilin過表達(dá)的穩(wěn)定克隆中恢復(fù)β-catenin的表達(dá)能部分恢復(fù)細(xì)胞的侵襲能力，說明migfilin對細(xì)胞活動(dòng)能力的影響至少部分是由于migfilin引起的β-catenin的蛋白降解所介導(dǎo)的。
　　 綜上所述，我們認(rèn)為migfilin應(yīng)該是通過影響食管癌細(xì)胞的黏附形