肝細(xì)胞生長因子質(zhì)粒DNA在肝組織工程中的應(yīng)用研究.pdf

1、目前因肝臟疾病而引起的人類死亡正在逐年增多，作為肝移植替代療法的肝組織工程研究已成為當(dāng)前令人矚目的再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。肝組織工程支架作為肝組織工程三大基本要素(即肝種子細(xì)胞、生長因子和肝組織工程支架)之一，其不僅能為肝組織再生提供必需的三維空間，而且作為各種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及功能表達(dá)等生物活性因子的載體，成為仿生構(gòu)建肝細(xì)胞外微環(huán)境的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于生長因子等生物活性蛋白半衰期短且其在與材料的復(fù)合過程中易失活等原因，近年利用基因工程的

2、方法，在支架上復(fù)合生長因子的基因，通過基因轉(zhuǎn)染使細(xì)胞高水平表達(dá)其蛋白并作用于細(xì)胞的研究受到了組織工程研究者們的青睞。
　　 本文旨在構(gòu)建可表達(dá)HGF和紅色熒光蛋白(RFP)融合蛋白基因質(zhì)粒，并利用非病毒基因載體聚乙烯亞胺(PEI)探索其在肝細(xì)胞共培養(yǎng)及HGF基因裝載肝組織工程支架誘導(dǎo)肝細(xì)胞再組織化研究中的應(yīng)用。
　　 本研究首先以pMD19－T-HGF為模板PCR擴(kuò)增HGF基因全長序列，定向插入pDsRed-expres

3、s-N1質(zhì)粒，完成HGF和紅色熒光蛋白(RFP)融合蛋白基因質(zhì)粒的構(gòu)建。其經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測(cè)定及293T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均表明，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了可用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染并表達(dá)的HGF－紅色熒光融合蛋白基因質(zhì)粒，并優(yōu)化了其真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染條件。
　　 本研究中以PEI為基因轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3)，并分別做了其與原代肝細(xì)胞的二維、三維共培養(yǎng)研究，結(jié)果表明共培養(yǎng)中3T3表達(dá)的外源HGF蛋白顯著改善了肝細(xì)胞的尿

4、素合成功能，同時(shí)也表明共培養(yǎng)中外源HGF蛋白的表達(dá)及肝細(xì)胞與異源非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的接觸可進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞聚集體的形成及其肝功能的表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了聚陰離子(海藻酸)和聚陽離子(殼聚糖)支架組成對(duì)界面修飾法裝載HGF基因及其控釋等行為的影響，125I標(biāo)記基因?qū)嶒?yàn)表明支架中聚陰離子組分依賴靜電作用力有利于DNA/PEI復(fù)合物的固定及控釋，結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了多糖支架的DNA裝載條件，結(jié)果表明聚陰離子載HGF-RFP基因支