牙周組織工程中血小板源性生長因子應用的初步研究.pdf

1、目的：本研究通過培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞，采用冷凍干燥法制備殼聚糖/磷酸三鈣復合材料并將血小板源性生長因子、殼聚糖/磷酸三鈣支架材料及牙周膜成纖維細胞進行體外聯(lián)合培養(yǎng)，初步探討血小板源性生長因子對牙周膜成纖維細胞在該支架材料上三維立體培養(yǎng)的影響，為今后血小板源性生長因子在牙周組織工程中的進一步應用提供實驗基礎(chǔ)。 方法：本研究分為兩部分： 1、人牙周膜成纖維細胞(periodontalligamentfibroblast，P

2、DLF)的體外培養(yǎng)及鑒定：取臨床上因正畸治療需要而拔除的健康新鮮減數(shù)牙，洗去根面血污后刮取根中1/3處的牙周膜組織，用組織塊培養(yǎng)法進行人PDLF的原代培養(yǎng)，按1:4傳代培養(yǎng)，取第5代細胞用于實驗。以廣譜角蛋白、波形蛋白按常規(guī)ABC法鑒定細胞起源；倒置顯微鏡觀察原代及傳代培養(yǎng)的PDLF細胞。 2、血小板源性生長因子(plateletderivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)與殼聚糖/磷酸三鈣支架材料應用于牙周組

3、織工程的初步研究：采用殼聚糖和磷酸三鈣通過冷凍干燥法制備成殼聚糖/磷酸三鈣(Chitosan/Tricalciumphosphate，CTCP)復合材料，并將已純化且連續(xù)傳代的第五代PDLF在CTCP支架材料上進行培養(yǎng)。并按加入培養(yǎng)液的不同進行分組。以單純加入DMEM培養(yǎng)液為對照組；以加PDGF-BB為實驗組：將PDGF-BB用DMEM培養(yǎng)液稀釋，按終濃度分為以下三組：1ng/ml組、10ng/ml組、100ng/ml組。各濃度PDGF

4、-BB組及對照組分別接種9份標本。標準環(huán)境下(37℃、5％CO2、飽和濕度)孵育24h，對細胞計數(shù)，折算成每平方毫米面積的材料上細胞數(shù)，再計算每組的平均值。按同樣的分組方法，每孔接種細胞懸液后在標準環(huán)境下孵育24h后棄去液體，實驗組加入含PDGF-BB的DMEM培養(yǎng)液，PDGF-BB終濃度同前，對照組只加DMEM培養(yǎng)液。標準環(huán)境下孵育72h后對細胞計數(shù)，方法同前。并分別在培養(yǎng)24h和72h后，PDGF-BB(100ng/ml)組和對照組

5、各隨機取出1份標本行掃描電鏡觀察。各組樣本實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，行單因素方差分析。采用SPSS11.0軟件計算。72h增殖率=(72h吸附細胞數(shù)-24h吸附細胞數(shù))/24h吸附細胞數(shù)。 結(jié)果：掃描電鏡結(jié)果顯示CTCP支架材料具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙互相通連。細胞在支架材料上可呈長梭形、圓形或成片生長。PDGF-BB(100ng/ml)組較對照組其細胞與CTCP支架材料的伸展更充分，附著狀態(tài)有所改善。細胞計數(shù)結(jié)果顯示：與對照組

6、相比，各濃度PDGF-BB組培養(yǎng)24h后均可促進hPDLF在CTCP支架材料上的附著，呈濃度依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中100ng/ml為最有效濃度。同時，不加PDGF-BB時，72hhPDLF增殖率為41.4％；加入1ng/ml、10ng/ml和100ng/mlPDGF-BB時，hPDLF其72h增殖率分別為為143.0％、188.6％和217.4％：與24h結(jié)果相比，PDGF-BB各濃度組培養(yǎng)72h后均能促進h

7、PDLF在CTCP支架材料上的增殖，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)采用冷凍干燥法制備的殼聚糖-磷酸三鈣復合支架材料具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)，能夠滿足組織工程支架材料的基本要求。人牙周膜成纖維細胞與殼聚糖.磷酸三鈣復合材料具有良好的細胞相容性和細胞親和性。 (2)PDGF-BB能促進人牙周膜成纖維細胞在殼聚糖-磷酸三鈣復合支架材料上的增殖，并可改善人牙周膜成纖維細胞在殼聚糖-磷酸三鈣復合支架材料