當(dāng)歸對小鼠骨髓細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)細(xì)胞信號通路的研究.pdf

1、本論文研究中藥，主要是當(dāng)歸對小鼠骨髓細(xì)胞增殖的影響，及對MAPK，JAK-STAT兩條細(xì)胞信號通路的作用。 論文分為三部分內(nèi)容。 第一部分是藥物的選擇和作用條件的優(yōu)化。根據(jù)中藥的藥性，選擇了4種有代表性的藥物，即補(bǔ)血藥當(dāng)歸，理氣藥黃芪，滋陰藥枸杞和祛風(fēng)濕藥雷公藤。采用這4種藥物的制劑，觀察對小鼠骨髓細(xì)胞增殖的影響。 粒單核祖細(xì)胞集落形成及髓過氧化物酶活性測定結(jié)果表明，當(dāng)歸和黃芪提取物具有促進(jìn)粒單核細(xì)胞系列增殖的能

2、力。分別檢測了0.1mg/ml,1mg/ml,10mg/ml3個不同劑量，作用有量效關(guān)系。當(dāng)歸提取物的作用在10mg/ml劑量較強(qiáng)，能增加CFU-GM形成數(shù)73％，MPO比酶活369％；而黃芪提取物的作用在1mg/ml劑量較強(qiáng)，使CFU-GM形成數(shù)增加22％，MPO比酶活增加96％。 枸杞中的提取物——枸杞多糖在0.01mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml濃度未檢測到對CFU-GM形成數(shù)和MPO比酶活的影響。 雷公

3、藤制劑——雷公藤多苷的作用是抑制性的，以0.01mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml三個不同濃度進(jìn)行研究，1mg/ml劑量作用較強(qiáng)，使CFU-GM形成數(shù)下降41％，MPO比酶活下降77％。 根據(jù)上述結(jié)果，從中選擇具有良好促骨髓細(xì)胞增殖能力的當(dāng)歸進(jìn)行作用條件優(yōu)化，繼而進(jìn)一步深入研究。 以密度梯度離心法從小鼠骨髓中分離出單個核細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)比色法測定其生長增殖能力。分別對細(xì)胞培養(yǎng)第1-7天每日測定，作出細(xì)胞生長曲線。

4、結(jié)果表明，第3天是明顯的快速增殖期，適合于進(jìn)一步研究。 在新鮮分離的單個核細(xì)胞中加入不同濃度的當(dāng)歸注射液，比較細(xì)胞生長增殖速度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1mg/ml濃度具有較強(qiáng)的作用效果。 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液中的胎牛血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長的活性因子，可能掩蓋藥物作用，因此，在短期培養(yǎng)中目前有許多研究采用無血清培養(yǎng)。我們采用10％胎牛血清，5％胎牛血清，無血清3種不同條件的培養(yǎng)液，觀察當(dāng)歸的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無血清條件下

5、當(dāng)歸注射液呈現(xiàn)出明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力，在作用較強(qiáng)的1mg/ml劑量，能增加單個核細(xì)胞增殖444％。而在含10％胎牛血清及5％胎牛血清的培養(yǎng)液，當(dāng)歸的促增殖作用在很大程度上被細(xì)胞的背景增殖所掩蓋。因此，在后面細(xì)胞信號通路的研究中，我們采用無血清或根據(jù)方法要求采用背景很低的0.5％血清。 論文的第二部分是當(dāng)歸制劑對單個核細(xì)胞增殖中MAPK信號通路的影響。 MAPK細(xì)胞信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖的一條重要途徑，在細(xì)胞內(nèi)信號傳

6、遞中起樞紐性作用。它的核心過程是MAPKKK→MAPKK→MAPK的三級傳遞。MAPK有多種亞型，不同的亞型引起不同的細(xì)胞變化。ERK1/2,SAPK/JNK,P38是三種主要的亞型。 MAPK蛋白通過關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的磷酸化而活化，這種變化可用特異性抗體加以檢測。在本文中，采用流式細(xì)胞術(shù)方法研究MAPK蛋白的活化。 對當(dāng)歸刺激后單個核細(xì)胞的MAPK分析表明，ERK1/2和P38MAPK蛋白被磷酸化活化，作用自當(dāng)歸刺激30

7、min后開始。而SAPK/JNK蛋白無明顯變化。 進(jìn)一步需要研究MAPK蛋白的這種變化對于細(xì)胞增殖有什么意義。我們選擇以MAPK特異性抑制劑阻斷通路，觀察細(xì)胞增殖的相應(yīng)變化。 以ERK1/2抑制劑PD98059與單個核細(xì)胞共孵育，當(dāng)歸促增殖作用下降了57.3％；P38抑制劑SB203580則使當(dāng)歸作用減少42.7％，而SAPK/JNK抑制劑SP600125對當(dāng)歸作用無明顯影響。 上述結(jié)果證明，在當(dāng)歸引起的小鼠骨髓

8、單個核細(xì)胞增殖中，ERK1/2和P38MAPK起到了介導(dǎo)作用。 本論文的第三部分是研究當(dāng)歸制劑對另一條細(xì)胞信號通路——JAK-STAT信號通路的影響。 JAK-STAT信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要途徑，細(xì)胞外的化學(xué)信號經(jīng)過膜上受體，激活JAK，繼而活化STAT。胞漿中的STAT激活后移行入核，與DNA相應(yīng)片斷結(jié)合，引起相關(guān)基因的活化。與MAPK信號通路相仿，STAT元件也有多種形式，包括STAT1-6,它們常常以組合的方

9、式發(fā)生反應(yīng)，如STAT1和STAT2,STAT3和STAT4,STAT5和STAT6。 在本論文中，我們以經(jīng)典的Westernblot方法檢測STAT的活化狀態(tài)，選擇STAT1,STAT3和STAT5作為研究對象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)歸刺激后，單個核細(xì)胞的STAT3和STAT5被磷酸化活化，而STAT1活性不變。 STAT3的磷酸化位點(diǎn)有2個，Ser727和Tyr705,Tyr705-STAT3在當(dāng)歸作用20min后開始激活