苯吸入對小鼠骨髓細胞凋亡及HDAC酶活性的影響.pdf

1、目的：苯與人們的工作生活息息相關(guān)，它對人體產(chǎn)生的危害受到了全世界的關(guān)注，為一種明確的致癌物質(zhì)，近年來人們致力于苯接觸對人體產(chǎn)生毒害的研究[1]。骨髓細胞是苯誘導(dǎo)產(chǎn)生毒性的靶器官之一，體外研究顯示[2,3]口苯及其代謝產(chǎn)物如氫醌可引起人骨髓細胞的凋亡及DNA加合物形成，并可引起表觀遺傳學(xué)改變，通過影響TOPOⅡα啟動子相關(guān)基因的甲基化和組蛋白的乙?；揎棧淖兤渫?fù)渥饔?，影響基因的正常轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和蛋白的翻譯，最終遺傳學(xué)改變。同時大量的苯中

2、毒動物模型[4-6]《研究顯示在體內(nèi)苯及其代謝物也可引起骨髓細胞的凋亡，致外周血三系明顯下降，對組織器官產(chǎn)生各種氧化應(yīng)激損傷，以及對DNA的損傷，本課題組旨在進一步研究苯在小鼠體內(nèi)致小鼠造血系統(tǒng)損傷是否是通過影響組蛋白乙?；揎椩斐傻?。
　　1、觀察苯吸入誘導(dǎo)造血系統(tǒng)毒性的小鼠模型情況。
　　2、觀察不同濃度苯吸入后對CD1雄性小鼠骨髓細胞凋亡情況的影響。
　　3、觀察苯吸入后對CD1雄性小鼠骨髓單個核細胞的組蛋白去乙

3、?；?HDAC)活性的影響。
　　方法：(1)自制動式苯吸入裝置:取50ml無菌注射器抽取分析純苯35ml左右，置于便攜式微量注射泵上，調(diào)節(jié)參數(shù)為20ml模式下，速度8-9mm/小時，通過一軟管針頭滴注入一個250ml棕色玻璃瓶橡膠塞內(nèi)，并連接一個小量程氣泵提供帶苯入裝置的氣流;玻璃瓶橡膠塞上另接出一塑料軟管連接進入100L塑料箱中;再取一根連接電磁式空氣壓縮機的橡膠軟管也接入100L塑料箱中，提供給小鼠呼吸的氧氣，并可以通過內(nèi)

4、嵌在塑料箱中的風(fēng)扇將苯氣體帶入塑料箱內(nèi);在第一個箱子排氣孔處用直徑20cm的塑料軟管連接另一個相同的塑料箱，并從連接電磁式空氣壓縮機的橡膠軟管中分接一根橡膠軟管接入第二個塑料箱中，通過內(nèi)嵌的風(fēng)扇提供該裝置內(nèi)小鼠氧氣及帶動第一個箱子排進來的苯氣體，裝上空氣調(diào)節(jié)閥以調(diào)控進入兩個塑料箱的空氣量以便調(diào)整兩個箱子內(nèi)苯濃度。啟動整套裝置時，用膠帶將整個裝置密封，接出一根塑料管供苯濃度檢測儀監(jiān)控裝置內(nèi)氣體中苯濃度。
　　(2)造模及實驗方法:8

5、-9周齡CD1雄性小鼠在裝置中吸入苯氣體，6小時/天，5天/周，300ppm維持3個月;900ppm維持3個月。末次吸苯第二天用摘眼球取血法將正常對照組和苯吸入實驗?zāi)Ｐ徒M小鼠處死;并分離雙側(cè)股骨及脛骨，用1ml注射器沖洗骨髓腔，獲得部分骨髓細胞進行流式骨髓細胞凋亡檢測。
　　(3)將其余骨髓細胞使用小鼠外周血淋巴細胞分離液獲得骨髓單個核細胞，提取骨髓單個核細胞核蛋白，檢測核蛋白濃度，將目的蛋白濃度過低的進行蛋白濃縮，應(yīng)用去乙?；?/p>

6、(HDAC)試劑盒檢測HDAC酶活性變化。
　　結(jié)果：1、①300ppm，3個月苯吸入模型組小鼠的白細胞，血紅蛋白，血小板，脾體指數(shù)均較正常對照組明顯下降，與正常對照組相比分別下降了78.1％，34.2％,15.23％,60.6％(P＜0.05)。
　?、?00ppm，3個月苯吸入模型組小鼠的白細胞，血紅蛋白，血小板，脾體指數(shù)均較正常對照組明顯下降，與正常對照組相比分別下降了82.7％，29.9％,52.6％,60.8％。(

7、P＜0.05)
　　苯吸入模型小鼠肝臟病理結(jié)果顯示肝造血細胞減少，非造血細胞增多，肝細胞脂肪變性，胞漿疏松等病理改變;脾臟病理結(jié)果顯示脾臟萎縮，造血組織減少等改變。各項指標(biāo)均提示苯誘導(dǎo)小鼠造血系統(tǒng)毒性模型制作成功。（以上各項具體結(jié)果請參見同課題組，陳楓煜同期論文《苯致小鼠再生障礙性貧血模型的建立及對HDAC基因表達的影響》）。
　　2、流式細胞儀檢測骨髓細胞凋亡情況，流式結(jié)果顯示:
　　A、300ppm濃度苯吸入結(jié)果:

8、
　　(1)①300ppm濃度批正常對照組CD1雄性小鼠骨髓細胞（AnnexinⅤ+PI-）細胞比例8.33±0.61％;300ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI-)細胞比例13.8±5.31％。實驗小鼠骨髓細胞（AnnexinⅤ+PI-）細胞比例是正常小鼠的1.65倍。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。
　　②300ppm濃度批正常對照組CD1雄性小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI+)細胞比例2.5

9、3±0.9％;300ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI+)細胞比例2.80±0.55％。組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　B、900ppm濃度苯吸入結(jié)果:
　　(2)①900ppm濃度批正常CD1雄性小鼠骨髓細胞（AnnexinⅤ+PI-）細胞比例7.16±2.18％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI-)細胞比例13.1±5.39％。實驗小鼠骨髓細胞（AnnexinⅤ+P

10、I-）細胞比例是正常小鼠的1.83倍。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。
　?、?00ppm濃度批正常對照組CD1雄性小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI+)細胞比例4.54±0.84％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI+)細胞比例7.11±3.54％。實驗小鼠骨髓細胞比例是正常小鼠的1.57倍。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　C、300ppm與900ppm濃度兩組間進行比較:

11、>　　(1)300ppm濃度本吸入小鼠骨髓細胞（AnnexinⅤ+PI-）細胞比例13.8±5.31％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞（AnnexinⅤ+PI-）細胞比例13.1±5.39％，兩者之間進行對比，發(fā)現(xiàn)P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)300ppm濃度本吸入小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI+)細胞比例2.80±0.55％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞(AnnexinⅤ+PI+)細胞比例7.27±

12、3.59％，兩者之間進行對比，實驗組是正常組2.59倍，P＜0.05，有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3、正常CD1雄性小鼠骨髓細胞組蛋白HDAC酶活性5.0±1.52×10-3(OD值/μg);900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細胞組蛋白HDAC酶活性7.89±2.58×10-3（OD值/μg）。實驗小鼠骨髓細胞HDAC酶活性是正常小鼠的1.58倍，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、成功建立安全有效的苯吸入誘導(dǎo)CD