雷帕霉素對膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖代謝的影響及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、目的:
　　膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦部腫瘤，且多數(shù)切除后有復(fù)發(fā)可能。目前，針對惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等方面的研究十分普遍。臨床上使用的抗腫瘤藥物大都是通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮作用的。PI3K/Akt/mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中過度激活，調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。mTOR是P13K/Akt信號通路下游重要的激酶，參與調(diào)控包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生存和增殖。雷帕霉素是mTOR的抑制劑，能通過抑制

2、mTOR的活性，參與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路在惡性腫瘤細(xì)胞中的作用。然而，關(guān)于雷帕霉素治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用及相關(guān)分子機制尚未研究清楚。
　　在惡性腫瘤細(xì)胞中，糖酵解水平異常升高，多種糖酵解酶的表達(dá)和活性被過度激活，提示糖酵解途徑可能為抗癌治療提供豐富的靶點。最近有研究報道，microRNA-143受mTOR通路調(diào)控，且在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常下調(diào)，其靶基因包括糖酵解關(guān)鍵限速酶己糖激酶2(HK2)。然而，關(guān)于mTOR通

3、路、miRNA-143以及糖酵解途徑在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的調(diào)控作用及三者之間的關(guān)系尚不清楚。
　　本研究利用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和CHG-5，探索雷帕霉素在增殖、凋亡、糖酵解等多個方面對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的調(diào)控作用，并探討相關(guān)的分子調(diào)控機制。
　　方法:
　　1)用100 mM的雷帕霉素分別處理人膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，MTT法檢測U251和CHG-5細(xì)胞的增殖能力。
　　2)用100 mM

4、的雷帕霉素處理人膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，F(xiàn)CM檢測U251和CHG-5細(xì)胞凋亡水平的改變。
　　3)用100 mM的雷帕霉素處理人膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，Western Blotting檢測磷酸化的S6激酶蛋白分子的表達(dá)水平。
　　4)用100 mM的雷帕霉素分別處理人膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，檢測葡萄糖攝取和乳酸分泌的變化。
　　

5、5)用100 mM的雷帕霉素分別處理人膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，分別檢測己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的活性。
　　6)用100 mM的雷帕霉素分別處理人膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，Western Blotting分別檢測己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的蛋白表達(dá)水平。
　　7)用100 mM的雷帕霉素分別處理人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，

6、Realtime qRT-PCR檢測miR-143的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，細(xì)胞的增殖呈下降的趨勢。
　　2)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，細(xì)胞凋亡呈上升的趨勢。
　　3)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U2

7、51和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，S6K的磷酸化水平呈下降的趨勢，提示mTOR活性受抑制。
　　4)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，細(xì)胞葡萄糖攝取和乳酸分泌量呈下降趨勢。
　　5)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶、丙酮酸激

8、酶和乳酸脫氫酶的活性明顯下調(diào)。
　　6)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶（HK2）、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。
　　7)用100 mM的雷帕霉素分別處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251和CHG-5細(xì)胞0、6、12、24 h，隨著處理時間的延長，miR-143的表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1

9、)雷帕霉素通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，同時誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。
　　2)雷帕霉素通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，進(jìn)而抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解水平，這可能是導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖變慢的重要原因。
　　3)雷帕霉素通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，上調(diào)了miR-143的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)了糖酵解限速酶HK2的表達(dá)，從而下調(diào)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解水平。